Voor wie eiwitten nauwkeurig wil analyseren is massaspectrometrie vandaag de dag de aangewezen techniek. Hierbij vliegen, na het opknippen, miljoenen fragmentjes de massaspectrometer in. Die meet vervolgens de massa van elk fragment tot op een fractie van een atoom, en puzzelt met databanken en algoritmen de stukjes aan elkaar tot de complete aminozuursequentie.

’Tot onze verbazing was die stroom groot genoeg om eiwitten door de tunnel te trekken’

Giovanni Maglia, Rijksuniversiteit Groningen

Helaas gaat er op die manier ook een schat aan informatie verloren. Zo heeft de techniek moeite met het meten van posttranslationele modificaties – wijzigingen aan de structuur van een eiwit tijdens of na de aanmaak ervan. ‘Net die aanpassingen vertellen ons veel over de functie van een eiwit en hun disfunctie in ziektes’, zegt biofysicus Giovanni Maglia van de Rijksuniversiteit Groningen. ‘Maar doordat massaspectrometrie een grote groep eiwitstukjes tegelijk meet, valt niet altijd terug te rekenen hoe die modificaties over de eiwitten verdeeld waren.’ Daarom is er veel aandacht voor het ontwikkelen van technieken voor single-molecule protein analysis om eiwitten enkelvoudig en geheel in kaart te brengen. Uit dit vakgebied ontsproten de afgelopen paar jaar verschillende startups die allemaal eenzelfde beeld schetsen: de studie van individuele eiwitten staat voor de deur.

Tot (en door) het gaatje

Een veelbelovende werkwijze om eiwitten één voor één te bestuderen is met de inzet van nanoporiën. Deze piepkleine tunneltjes, doorgaans transmembraaneiwitten, zijn al volop in gebruik om DNA-sequenties grootschalig te bepalen. Hierbij staat een spanning over de nanoporie, en genereert deze een nucleotide-afhankelijk signaal wanneer een enkelvoudige DNA-streng door de porie stroomt – door de karakteristieke verstoring in de elektrische stroom te meten voor elke langskomende nucleotide. Volgens hetzelfde principe zijn nanoporiën ook bruikbaar om een aminozuur-afhankelijk signaal te creëren, wat het uitlezen van de aminozuursequentie van individuele eiwitten (inclusief posttranslationele modificaties) mogelijk zou maken.

Toch bleef deze toepassing lang buiten bereik. Dat nanoporiën in staat zijn DNA te sequensen, komt doordat het uniform geladen is. ‘Maar eiwitten bestaan uit positief en negatief geladen delen’, zegt Maglia. ‘Stel je voordat de positief geladen delen van een eiwit naar de porie bewegen, maar de negatief geladen delen het weer afstoten. Dan laat een eiwit zich niet door de tunnel trekken. Om die reden dachten onderzoekers lang dat nanoporiën niet bruikbaar zijn om de sequentie van eiwitten te bepalen.’

Het waren Maglia en collega’s die dit probleem wisten te omzeilen door een grote elektro-osmotische stroom op te wekken – het fenomeen waarbij geladen deeltjes in de vloeistof de rest meeslepen. In een nanoporie stromen onder normale omstandigheden positief geladen ionen de ene kant op en negatief geladen ionen de andere. ‘Maar wij decoreerden de binnenkant van onze porie met negatief geladen aminozuren, waardoor enkel positief geladen ionen in de vloeistof door de tunnel konden stromen en zo een directionele stroming opleverden’, zegt Maglia. ‘Dit optimaliseerden we om een zo sterk mogelijke elektro-osmotische stroom te behalen, die tot onze verbazing groot genoeg was om eiwitten door de tunnel te trekken.’

‘Dit moet de techniek gevoelig genoeg maken om posttranslationele modificaties te detecteren’

Anastassia Vorobieva, VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie

Om een eiwit vervolgens aminozuur voor aminozuur door de porie te laten stromen, vouwen onderzoekers ze eerst open tot een lineaire polypeptideketen met behulp van enzymen of andere stoffen. Ook mogelijk is om het eiwit in kleinere peptiden op te knippen en die stuk voor stuk te analyseren, wat anders is dan massaspectrometrie waarbij je meerdere fragmenten tegelijk meet. ‘Nu is de uitdaging om een elektrisch signaal te genereren dat gevoelig genoeg is om alle twintig mogelijke aminozuren van elkaar te onderscheiden’, zegt structuurbioloog Anastassia Vorobieva. Aan het VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie in Brussel werkt ze met haar groep aan de novo ontwikkeling van synthetische transmembraaneiwitten met verschillende groottes. Die wil ze inzetten als nanoporiën met voldoende resolutie. ‘Hierbij veranderen we de grootte en vorm van de eiwittunnel, zodat deze beter aansluit op de aminozuren en ze daardoor beter kan identificeren’, legt Vorobieva uit. ‘Uiteindelijk moet dit de techniek gevoelig genoeg maken om posttranslationele modificaties zoals methylering te detecteren. Op die manier kunnen nanoporiën een uiterst verfijnde analyse geven van hoe een eiwit in elkaar zit.’

Voor het voetlicht

Waar nanoporiën met elektrische signalen functioneren, bouwen andere onderzoekers aan optische meetmethoden die individuele eiwitten ‘bijschijnen’. Aan de Technische Universiteit Delft werkt biofysicus Carlos de Lannoy aan een op fluorescentie-microscopie gebaseerde techniek die specifieke eigenschappen van antilichamen bij heel lage concentraties kan bepalen. De Lannoy: ‘Hiermee willen we medicijnontwikkelaars in staat stellen om veel makkelijker en veel vroeger in het proces de kwaliteit van hun product te beoordelen.’ De techniek maakt gebruik van verschillende fluorescente moleculaire sensoren – bestaande uit eiwitten of specifiek gevouwen DNA-strengen – die kortstondig aan specifieke structuren op het antilichaam binden en hierbij licht uitzenden. Hierbij immobiliseren de onderzoekers de te analyseren antilichamen op een oppervlak. Door vervolgens repetitief verschillende sensoren langs te stromen en te kijken welke kort blijven hangen, valt snel op de aanwezigheid van eigenschappen te testen. ‘Beeld je in dat een van de sensoren enkele seconden aan het antilichaam bindt, dan weer loslaat, vervolgens bindt een andere sensor, enzovoort’, zegt De Lannoy. ‘Zo bouw je gaandeweg een profiel op van een individueel antilichaam.’

‘Antilichamen kunnen op bijna ontelbare manieren van elkaar verschillen’

Carlos de Lannoy, Technische Universiteit Delft

Hierbij focussen de sensoren onder andere op de structuur van de twee suikerketens die bij antilichamen aan de ‘stam’ van het Y-vormige molecuul zitten. Deze ketens zijn heel bepalend voor de mogelijk therapeutische werking van het eiwit. Daarom ontwikkelden de Delftse onderzoekers bijvoorbeeld een sensor die zeer gevoelig is voor de aanwezigheid van zogeheten core-fucosen, kleine suikers op de ketens die beïnvloeden hoe goed het antilichaam het immuunsysteem kan activeren. Ook maakten ze een sensor voor siaalzuur aan het uiteinde van de ketens, omdat de aanwezigheid daarvan bepaalt of het lichaam het eiwit als lichaamsvreemd ziet en dus welke circulatietijd het heeft. ‘Antilichamen kunnen op bijna ontelbare manieren van elkaar verschillen’, zegt De Lannoy. ‘Als het bijvoorbeeld gaat om al die soorten suikerketens, valt het nog helemaal niet mee om die met een massaspectrometer te onderzoeken. Met onze single-molecule analysetechniek vallen daarom extreem zeldzame varianten van eiwitten te ontdekken.’

Wilde Westen

Inmiddels beginnen deze technologieën langzaam de markt te betreden. Vier jaar geleden richtte Maglia samen met collega’s de startup Portal Biotech op, die hun nanoporiën commercialiseert voor single-molecule protein sequencing. De Lannoy is op zijn beurt CEO van de kersverse start-up Constellate Proteomics, die de fluorescente sensoren inzetten als volgende generatie eiwitanalyse-techniek voor biofarmaceuten. ‘Momenteel proberen heel veel verschillende technologieën het te maken in de wereld van single-molecule protein analysis’, zegt De Lannoy. ‘Waar de ene vooralsnog slechts een subset van de verschillende aminozuren kan identificeren, leest de andere de aanwezigheid van bepaalde subsequenties per eiwit uit, enzovoort. Wat dat betreft voelt het nog een beetje als het Wilde Westen.’

Of de nanoporiën bijvoorbeeld al gehele eiwitten kunnen sequensen, hangt af van welke definitie je hanteert. ‘De variatie in een signaal gegeven door een eiwit van honderden aminozuren met twintig verschillende aminozuren is astronomisch groot’, zegt Maglia. ‘Het lukt ons al om individuele aminozuren te herkennen en een signaal te genereren dat uniek is voor elk eiwit, maar nu moeten we alle puzzelstukjes samenbrengen. Het zal tijd kosten om elke permutatie van zo’n signaal correct te interpreteren.’ Met name de identificatie van posttranslationele modificaties blijft voorlopig nog een uitdaging. ‘Hiervoor hebben we nog veel werk aan de winkel’, zegt Vorobieva. De Lannoy is het daarmee eens: ‘De absoluut uitzinnige diversiteit in kaart brengen die posttranslationele modificaties teweegbrengen zal nog een tijdje heel lastig blijven.’