Single particle cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is tegenwoordig de aangewezen techniek om de structuur van eiwitten te meten. Door duizenden tot een paar miljoen exemplaren van een gepurificeerd eiwit in een nanometer-dik laagje ijs te visualiseren, kan de techniek het eiwit met atomaire precisie driedimensionaal in beeld brengen.

Hiervoor heeft een sample in theorie enkel een paar picogram van het eiwit nodig, dat je uit een enkele celkolonie kunt zuiveren. Maar in de realiteit lukt het nog niet om eiwitten in zo’n minimale, homogene hoeveelheid te zuiveren en rechtstreeks in de samplehouder te krijgen. Je hebt eerder haast een miljoen keer meer aan biologisch materiaal nodig. Door dit knelpunt blijft de structuurbepaling van bepaalde eiwitten buiten de mogelijkheden.

Nu hebben structuurbiologen van de Vrije Universiteit Brussel (VUB) een nieuwe micro-isolatiemethode ontwikkeld die microfluïdische eiwitpurificatie combineert met de preparatie van het cryo-EM-grid – de samplehouder in de elektronenmicroscoop. Ze valideerden hun methode door de structuur van bacteriële en eukaryotische membraaneiwitten te bepalen uit minder dan een microgram van het eiwit. Daarbij had de overstap van cellen naar het cryo-EM-grid slechts enkele uren nodig.

Structuurbioloog Rouslan Efremov van de VUB, die het onderzoek leidde: ‘Voorheen moesten onderzoekers tot wel 150 petrischalen vol cellen opkweken om voldoende eiwitten te zuiveren voor hun structuurbepaling. Wij laten zien dat MISO met slechts een halve petrischaal aan cellen hetzelfde resultaat bereikt.’

Miniatuur-methode

Voor de huidige workflow van single particle cryo-EM hebben onderzoekers enkele milligrammen aan gezuiverde eiwitten nodig; een miljoen keer meer dan wat ze uiteindelijk visualiseren. Vanwege die relatief grote hoeveelheid is het onmogelijk om de structuur van eiwitten uit individuele patiëntweefsels te bepalen. Efremov: ‘Wij wilden het voorbereiden van het cryo-EM-sample versimpelen door alle stappen samen te brengen op een microfluïdische chip.’

Het resultaat, MISO, purificeert eiwitten op een microfluïdische chip en laadt ze vervolgens via een capillair op het cryo-EM-grid. ‘Manueel pipetteren onderzoekers meestal enkele microliters van hun gepurificeerde eiwit op dit grid’, zegt Efremov. ‘Onze chip kan een tiental nanoliters van het eiwit doseren.’

Doorstromende workflow

In plaats van milliliters aan buffer hadden de onderzoekers slecht een tiental microliters nodig om de structuur van verschillende bekende membraaneiwitten te bepalen. ‘In essentie is het zuiveringsproces dat we op onze chip gebruiken hetzelfde als wat standaard opstellingen gebruiken’, zegt Efremov. ‘Het verschil zit hem in de schaal. Onze zuiveringskolommen zijn een factor duizend kleiner, waardoor we met veel kleinere volumes kunnen werken.’

Hoewel het idee – alle stappen verkleinen en integreren op een chip – simpel klinkt, was het volgens Efremov erg lastig om uit te voeren. ‘De grote uitdaging was om de hele workflow in een keer te doorlopen op een chip. In het lab heb je tussenstappen, waarbij je bijvoorbeeld gezuiverde eiwitten in een proefbuisje houdt. Maar de volumes in een microfluïdische chip zijn zo klein dat je die niet even eruit kunt halen om opzij te zetten. Het vereiste flink wat werk om alles reproduceerbaar en betrouwbaar in één keer te doorlopen, van cel-extractie tot het laden in het cryo-EM-grid.’

Brede inzet

Nu hopen de onderzoekers de inzet van MISO uit te breiden. ‘Onze huidige chip is gemaakt uit het polymeer PDMS. Nu zijn we aan het kijken om een prototype in grote hoeveelheid uit thermoplastics te maken, die je dan relatief goedkoop in verschillende laboratoria kunt gebruiken.’

Ook willen de onderzoekers bepalen hoe breed toepasbaar MISO is. Zo willen ze er de structuur van andere eiwitten mee bepalen. De focus ligt met name op eiwitten uit menselijke weefsels. ‘Het bepalen van de structuur van eiwitten uit menselijke of zelfs patiëntweefsels kan inzichten geven in de invloed van specifieke ziekten of mutaties. Als we deze lage aantallen dankzij MISO in beeld kunnen brengen, zou dat baanbrekend zijn.’

Eluru, G. et al. (2025) Nat Methods, DOI: 10.1038/s41592-025-02894-x