In de zeventiende eeuw maakte de Delftse handelsman Antoni van Leeuwenhoek prachtige lenzen, waarmee hij de voorheen onzichtbare wereld van cellen onthulde. Hoewel destijds de beste lens het mooiste beeld kon maken, geldt dat inmiddels al lang niet meer. ‘Nu gaat het om de slimme inzet van je microscoop in combinatie met algoritmes’, zegt werktuigbouwkundige Carlas Smith, eveneens in Delft geworteld aan de TU. ‘Hoeveel informatie zit er in het plaatje dat de camera vastlegt, en hoe verwerk je deze voor een zo goed mogelijke reconstructie?’

Smith werkt met zijn groep aan verschillende technieken voor superresolutie-microscopie. Het doel: scherper dan ooit in levende weefsels kijken. Daarbij ligt de meest optimale resolutie voor lenzen rond de 250 nanometer, bepaald door de diffractielimiet – de fundamentele natuurkundige ondergrens aan de scherpte van een optisch systeem, veroorzaakt door het buigen van lichtgolven en de maximale hoek waarmee het licht wordt opgevangen. Maar daar weet een centrale superresolutie-methode, Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), ruim overheen te komen. Deze techniek, die slim gebruik maakt van fluorescente eiwitten en algoritmes die een afbeelding reconstrueren uit de ruis van deze lichtsignalen, is nog wel vijventwintig keer zo nauwkeurig. Door daarbovenop de belichting tijdens acquisitie aan te passen, zogeheten Iterative Single-Molecule Localization Microscopy (ISMLM), is het resultaat zelfs honderd keer zo nauwkeurig te maken.

‘Als je te veel iteraties gebruikt, kun je de precisie juist slechter maken’

Carlas Smith, TU Delft

Toch heeft ook de ISMLM-techniek een ondergrens. In 2022 publiceerde Smith samen met eerste auteur Dylan Kalisvaart dat de meest optimale resolutie van ISMLM een stuk minder is dan waar het veld eerder vanuit ging. Hoe zit dat? En waar zijn de grenzen van het zichtbare nog op te rekken? 

A priori

SMLM berust op fluorescente eiwitten die na belichting van een laser slechts één voor één kort knipperen onder de microscoop. ‘Je legt deze moleculen afzonderlijk en herhaaldelijk vast, waarbij je steeds wacht tot de ene subset “uit” gaat en de andere “aan”’, legt Smith uit. ‘Door dit lange tijd te doen, in zo’n tienduizend tot dertigduizend frames, kan je de positie van alle moleculen met een lokalisatie-algoritme bepalen.’

‘Iteratieve lokalisatie’, de basis voor ISMLM, baseert zich op veranderingen in de belichting. De afstand van de laser tot het molecuul bepaalt namelijk in hoeverre het molecuul licht uitzendt. Smith: ‘De belichting vertelt dus waar het fluorescente molecuul zit. Door herhaaldelijk met de laser van dichtbij of veraf te schijnen, krijg je zo steeds meer informatie over de positie van het molecuul.’

‘Bij het bestuderen van cellen in 3D worstelen we met de tijdsresolutie’ 

Pablo Hernández-Varas, VIB-KU Leuven

In 2020 stelde natuurkundige Stefan Hell van het Max Planck-instituut in Göttingen en Heidelberg, een van de Nobelprijswinnaars in 2014 voor super-resolutie microscopie, met zijn lab dat de resolutie van ISMLM met elke iteratie van de belichting exponentieel zou moeten toenemen. Maar, zo liet Smiths groep twee jaar later zien, dat is in de praktijk vrijwel onhaalbaar. ‘Voor ISMLM heb je a priori informatie nodig, namelijk waar ongeveer het molecuul zit. Je gebruikt dus tijdens het experiment informatie die al bekend is’, legt Smith uit. ‘Deze informatie had Hells groep niet meegenomen in hun berekeningen. Wij deden dat wel, en ontdekten dat als je in sommige gevallen te veel iteraties gebruikt, je de precisie juist slechter kunt maken.’

Tijdsresolutie

Hoeveel beter moeten superresolutie-technieken dan nog worden? Volgens Pablo Hernández-Varas, hoofd van de Bioimaging Core aan de VIB-KU Leuven, is dat sterk afhankelijk van wat je wilt doen: ‘In onze labs hebben we ongeveer driehonderd gebruikers, waarvan velen berusten op superresolutie-technieken voor onderwerpen van neurowetenschappen tot kankerbiologie. De resolutie die we nu behalen, rond de 20 nanometer, is daarvoor goed genoeg.’

‘Voor mijn onderzoek hebben we een sub-nanometer resolutie nodig’

Marrit Tholen, TU Eindhoven

Voor het bestuderen van levende cellen met dynamische moleculen ziet Hernández-Varas nu vooral een behoefte aan betere tijdsresolutie. Daar schaart ook biomedisch ingenieur Marrit Tholen van de TU Eindhoven zich achter. Met single-molecule tracking onderzoekt ze hoe verschillende receptoren en suikergroepen over cellen heen bewegen. ‘Momenteel behalen we een tijdsresolutie van twintig tot dertig milliseconden’, zegt Tholen. ‘Als we dat nog lager kunnen maken, zou ons dat meer informatie geven over hoe de receptoren bewegen.’ Hernández-Varas vult aan: ‘Bij het bestuderen van cellen in 3D is de tijdsresolutie zelfs in de ordegrootte van seconden. Daar worstelen we in ons onderzoek mee.’

Dat betekent niet dat er voor resolutie in de ruimte geen winst meer te behalen valt. Tholen: ‘Mijn onderzoeksveld is geïnteresseerd in de glycosylering van receptoren. Dan wil je zowel de receptor als de individuele suikergroepen kunnen zien. Daarvoor hebben we een sub-nanometer resolutie nodig.’

Optimale balans

Met zijn groep werkt Smith daarom aan technieken om een hoge tijdsresolutie én een hoge resolutie in de ruimte te combineren in een enkele microscoop. Daarbij komt een ingewikkelde wisselwerking kijken. Zo zorgen de vele frames die nodig zijn om een scherpe resolutie in de ruimte te bereiken automatisch voor een lagere tijdsresolutie. Smith: ‘Als je heel snel wil vastleggen hoe een molecuul rond beweegt, dan neemt het aantal moleculen dat je in een plaatje bij kan houden af. En als je voor een grotere field of view meer laserlicht gaat gebruiken, zorgt dat weer voor fototoxiciteit in je cellen. Om de tijdsresolutie te verbeteren, moeten we dus dingen in parallel gaan doen of met nieuwe innovaties komen.’

Aan de hand van computersimulaties zoeken Smith en collega’s naar een optimale balans. Met die kennis ontwerpen ze een nieuwe microscoop die parallelle data kan combineren. ‘In onze simulaties rekenen we door wat allemaal mogelijk is met het licht. Wat willen we doen, en hoe moeten we het ontwerp daarvoor aanpassen? Zo bouwen we aan verschillende microscopietechnieken, waarmee onderzoekers weer net iets meer kunnen doen dan eerder is gedaan