Er zijn vele manieren om erachter te komen hoe een enzym werkt, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese en eiwitstructuurstudies. Maar een misschien wel onderbelichte aanpak is de combinatie van ancestral sequence reconstruction en het produceren en testen van deze gereconstrueerde enzymen in het lab.

Wagenings onderzoek laat hier de kracht van zien. De groep onder leiding van Robin van Velzen, docent aan Wageningen University & Research, bestudeert al langere tijd cannabinoïde oxidocyclases, de enzymen die in cannabis verantwoordelijk zijn voor de productie van cannabinoïden zoals (−)-trans-Δ9-tetrahydrocannabinolzuur (THCA), cannabichromeenzuur (CBCA), of cannabidiolzuur (CBDA), die bij verhitting omgezet worden in de bioactieve stoffen THC, CBC, en CBD.

Ondanks het langdurige onderzoek naar deze enzymen, zaten de onderzoekers nog met twee vragen. Zo vroegen ze zich af wat de ontwikkelingsgeschiedenis was van de verschillende producten binnen deze enzymfamilie, maar ook was nog onbekend wat precies bepaalt welk product het enzym produceert. Om die vragen te beantwoorden combineerde postdoc Cloé Villard, inmiddels werkzaam aan de Universiteit van Amsterdam, haar biotechnologische expertise met de fylogenetische kennis van Van Velsen.

Roodkapje

Allereerst berekenden ze met ancestral sequence reconstruction hoe de enzymen er miljoenen jaren geleden waarschijnlijk uitzagen. ‘Je kan het vergelijken met tekstkritiek, bijvoorbeeld in het nagaan van wat de oorspronkelijke vertelling van het sprookje Roodkapje is aan de hand van de verschillende vertellingen van nu’, zegt Villard. ‘Je verzamelt zoveel mogelijk verhalen, die met de tijd in elk land net iets anders zijn gaan klinken, en probeert aan de hand van de verschillen en overeenkomsten het oorspronkelijke verhaal te reconstrueren.’

‘Met DNA doen we het net zo’, zegt Villard. Om achter de voorouderlijke enzymen te komen verzamelde ze zo veel mogelijk DNA-sequenties van cannabinoïde oxidocyclases en gerelateerde enzymen, zoals die van Berberine Bridge-Like-enzymen in hop, dat nauw verwant is aan cannabis. Vervolgens bepaalde Villard met behulp van een fylogenetische boom wat de meest waarschijnlijke nucleotidevolgorde was in de voorouderlijke enzymen.

In drie voorouderlijke enzymen was de groep vooral geïnteresseerd: de meest recente voorouder van THCA-synthase en CBCA-synthase; de voorouder van alle bekende cannabinoïde synthasen; en het voorouderlijke enzym van zowel de voorouder van alle cannabinoïde oxidocyclases als hun in hop aanwezige naaste verwanten. Villard liet deze enzymen ‘herrijzen’ door hun DNA te synthetiseren en vervolgens in gist tot expressie te brengen. Vervolgens bestudeerde ze de activiteit van de herrezen enzymen. Alleen het oudste voorouderlijke enzym had te veel moeite om CBGA (cannabigerolinezuur) in cannabinoïden om te zetten.

Ander perspectief

Daarnaast keek Villard ook naar hybride tussenvormen van opeenvolgende voorouderenzymen, door stapsgewijs de veranderde aminozuren toe te voegen aan de oudste variant van de twee. Zo gaf Villard het met hop gedeelde voorouderenzym achtereenvolgens het actieve centrum van de laatste gemeenschappelijke cannabinoïde oxidocyclase van cannabis. Vervolgens voegde ze daar de ontbrekende aminozuren uit de jongere voorouder aan toe, en verving als laatste ook de cannabis-specifieke regio waar de binding van een essentiële cofactor plaatsvindt. Het eerste hybride enzym zet CBGA alleen om in CBCA, iets wat geen van de moderne cannabinoïde oxidocyclases doen. De daaropvolgende hybride-enzymen zetten CBGA om in CBCA, THCA, en CBDA, en de laatste deed dat nog een stukje sneller.

‘Op deze manier zagen we het enzym vanuit een ander perspectief: we keken niet zozeer meer naar wat we aan het enzym konden toevoegen, maar meer naar hoe dit enzym zich heeft ontwikkeld’, zegt Villard. ‘Het teruggaan naar het verleden gaf ons nieuwe inzichten, die het mogelijk maakten om op delen van het enzym te focussen die we voorheen volledig over het hoofd zagen.’

Makkelijker

‘Deze studie laat behoorlijk overtuigend zien dat vanuit een enkel voorouderlijk enzym de huidige enzymen voor de productie van de cannabinoïden THCA, CBCA, en CBDA konden ontstaan’, zegt hoogleraar Todd Barkman, die eiwitevolutie in planten onderzoekt aan de Western Michigan University in de US, en de studie cool vindt. ‘Daarnaast laten ze zien dat, na de duplicatie van dit ene enzym in de meer recentere voorouders van cannabis, deze dochterenzymen steeds meer en meer gespecialiseerd werden.’

Dat laatste verklaart ook waarom het de onderzoekers maar niet lukt om THCA-synthase in een CBDA-synthase te veranderen. Behalve het actieve centrum is namelijk ook de rest van het THCA-synthase-enzym toegespitst op het produceren van THCA.

Behalve nieuwe inzichten heeft deze studie ook implicaties voor de industriële productie van cannabinoïden. Gist bleek de voorouderlijke enzymen namelijk veel makkelijker en in grotere hoeveelheden te produceren dan hun moderne nakomelingen. En de onderzoekers konden de voorouderlijke enzymen makkelijk aanpassen. ‘Dit opent de deur voor gerichte industriële productie van cannabinoïden’, zegt Barkman.

Villard, C.I. et al. (2025) Plant Biotechnology Journal, DOI: 10.1111/pbi.70475