Gemethyleerd DNA is thermisch zó veel stabieler dan ongemethyleerd DNA, dat je het verschil prima kunt zien met een standaard ‘high resolution melting’-apparaat. De gebruikelijke voorbehandeling met bisulfiet kun je net zo goed achterwege laten, zo schrijft Mike Wilkinson (Aberystwyth University, Wales) in het tijdschrift Analytical Chemistry.

Volgens Wilkinson kun je zelfs het verschil zien tussen DNA dat voor 0 en 1 procent is gemethyleerd, of voor 97,5 en 100 procent. Dat houdt in dat je één gemethyleerde cytosinebouwsteen in een DNA-oligomeer al kunt herkennen. Waar hij precies in de sequentie zit, kun je overigens niet zien.

Het belang van die methylering van cytosine zit in het feit dat ze de omzetting van de genetische code in eiwitten aanmerkelijk vertraagt. De laatste jaren groeit de belangstelling voor dit epigenetische’ effect, dat een belangrijk genetisch regemechanisme blijkt te zijn.

High resolution melting, afgekort HRM, komt er op neer dat je een DNA-monster langzaam opwarmt en kijkt bij welke temperatuur de strengen los van elkaar komen. Dat maak je zichtbaar met een kleurstof die fluoresceert zolang hij tussen de beide strengen hangt, maar niet meer wanneer hij er tussenuit valt. Tot nu toe wordt deze techniek vooral gebruikt om puntmutaties (SNP’s) snel op te sporen, op basis van het feit dat een guanine-cytosine-basenpaar thermisch wat stabieler is dan een adenine-thyminepaar.

Methylering is ook al eerder met HRM onderzocht. Maar dan altijd na een voorbehandeling met bisulfiet, die het verschil tussen gemethyleerd en ongemethyleerd chemisch flink uitvergroot. Bisulfiet zet door de-aminering ongemethyleerd cytosine om in uracil (een base die eigenlijk in RNA in plaats van DNA thuishoort), maar het laat methylcytosine ongemoeid. Uracil paart met adenine in plaats van met guanine, dus als je het behandelde DNA dupliceert in een PCR-apparaat krijg je kopieën met extra adenine-thymineparen en dus een lagere thermische stabiliteit.

Wilkinson stelt nu dus dat je zonder deze truc het verschil ook wel ziet. Zo ben je veel sneller klaar: een kwartiertje is voldoende.

Hij tekent er wel bij aan dat je er alleen mee kunt zien óf er veel cytosine in een monster is gemethyleerd. Dat kan bijvoorbeeld heel interessant zijn wanneer je fouten in het methyleringsmechanisme wilt onderzoeken.

Maar als je wilt weten wáár die methylering zit moet je nog steeds dat bisulfiet gebruiken, en vervolgens het resultaat sequensen. Met de HRM-techniek moet dit in principe ook wel zichtbaar zijn te maken, maar voorlopig is hij er nog niet gevoelig genoeg voor.

bron: C&EN

Onderwerpen