Op het gebied van de scheikunde is het vinden van nieuwe, efficiënte en schone manieren om amides te synthetiseren een belangrijk doel. ‘Tot nu toe hebben praktische beperkingen de ontwikkeling belemmerd, ook op het gebied van biokatalyse’, zegt Francesco Mutti, universitair hoofddocent Biokatalyse aan de Universiteit van Amsterdam. ‘In het afgelopen decennium zijn onderzoekers erin geslaagd om de vorming van amidebindingen in waterige omgevingen te versimpelen, maar hiervoor heb je ATP-geactiveerde enzymen nodig, die de industrie niet graag gebruikt.’

Mutti, Matteo Damian en hun collega’s hebben daarentegen een eenvoudig alternatief ontdekt waarvoor geen ATP nodig is. ‘Het is heel eenvoudig’, zegt promovendus Damian. ‘Je mengt gewoon een alcoholdehydrogenase-enzym in poeder- of vloeibare vorm met een cofactor, een alcohol en een tweede reagens om onder volledige omzetting een amide te maken.’ Het team gebruikt daarnaast gewoon lucht om zuurstof toe te voeren. ‘Alcoholen zijn goedkope en veelgebruikte substraten, en we kunnen zowel met de nucleofiel als met de promiscuïteit van het enzym spelen’, voegt Mutti toe. ‘Er is daarom geen reden meer voor de industrie om terughoudend te zijn met het gebruik van deze enzymen.’

Geluk

Hun publicatie in Angewandte Chemie International Edition over de synthese van amiden en thioesters met alcoholdehydrogenases (ADH’s) werd aangemerkt als een Very Important Paper. ‘Dit werk is vooral belangrijk in de farmaceutische industrie’, licht Mutti toe, ‘aangezien meer dan de helft van de tweehonderd best verkochte geneesmiddelen amidebindingen bevatten, die we hier hebben gecreëerd.’ Damian voegt toe: ‘Het is niet alleen de nieuwigheid van het werk, maar ook de impact ervan op de gemeenschap. Onze protocollen zijn eenvoudig te implementeren.’

Het begon allemaal met een van Mutti’s eerste promovendi, Jan Vilím, die alcoholen wilde omzetten in amines met een combinatie van enzymen. ‘Bij toeval ontdekte hij een nieuwe reactie waarbij een oxidase betrokken was, die alcoholen via een hemiaminal-tussenproduct kon omzetten in nitrillen – een werk dat ook in 2019 in Angewandte Chemie is gepubliceerd’, vertelt Mutti. Damian raakte geïnspireerd door deze reactie. ‘Ik heb een poster over zijn werk boven mijn bureau hangen en na wat literatuuronderzoek realiseerde ik me dat ik iets soortgelijks kon doen met alcoholdehydrogenasen via hetzelfde hemiaminal-tussenproduct, maar dan met de vorming van amides.’ Hij had geluk, zegt hij.

Blijkbaar is de reactiviteit van ADH’s breder en niet beperkt tot ammoniak als nucleofiel. Mutti: ‘We kunnen complexere amines en zwaveldonoren als substraten introduceren, en in de toekomst werkt het misschien ook voor andere nucleofielen. Het is work in progress!’

Onconventioneel project

Om dit te bereiken moesten ze echter een onconventionele aanpak hanteren. ‘Iedereen die met enzymen werkt, weet dat ze niet van hoge pH-waarden houden’, legt Damian uit. ‘Maar toen ik mijn perspectief verlegde van biokatalyse naar chemie, realiseerden we ons dat een hoge pH-waarde misschien wel zou werken voor de reactie die we wilden. Daardoor schoot onze opbrengst omhoog.’

Het project was ook in een ander opzicht bijzonder. ‘Matteo’s functie was een beetje een ‘troostfunctie’ voor een grotere subsidieaanvraag die niet werd gehonoreerd’, zegt Mutti. ‘Aanvankelijk was er onvoldoende financiering om het project te starten, dus in plaats daarvan verstrekte de universiteit financiering voor een interne PhD, wat heel zeldzaam is.’ Dit betekende dat er veel vrijheid was met betrekking tot zowel de projectdetails als de PhD-student.

’Het huidige systeem, waarin voorstellen worden beoordeeld door referenten en commissies, wordt over het algemeen beschouwd als de best mogelijke situatie. Maar soms leidt vrijheid zonder controle juist tot onverwachte resultaten. Het huidige peer-reviewsysteem is niet zo perfect als we denken. Ik betwijfel of een project als dit ooit zou worden goedgekeurd. Maar als je geen gekke projecten probeert, zullen belangrijke ontdekkingen nooit aan het licht komen.’

Damian voegt toe: ‘Vrijheid is belangrijk, maar toen ik promovendus was, had ik ondanks mijn harde werk aan het einde van mijn eerste jaar nog niet veel positieve resultaten geboekt. Toch bleef Francesco me vertrouwen, wat erg bemoedigend was.’ Mutti grijnst breed. ‘Matteo twijfelde toen een beetje aan zichzelf. Maar falen hoort bij het proces en elke promovendus maakt dat mee. Daarom is het cruciaal om vertrouwen te tonen in je studenten, vooral na het eerste jaar.’

Flow

Voorlopig is de schaal met 500 mg nog relatief klein. Er zijn echter een paar veelbelovende strategieën die het team zou kunnen implementeren om de opbrengst en omzetcijfers te verhogen. Zo zou het immobiliseren van het enzym in een flowsysteem de levensduur ervan kunnen verlengen, de beperkte substraatbelasting kunnen omzeilen en de schaalbaarheid kunnen verbeteren. ‘Bovendien hebben we nog geen technische aanpassingen gedaan om het enzym verder te stabiliseren’, besluit Mutti. ‘Door gebruik te maken van de modernste technische methoden om de stabiliteit te verbeteren, zou de levensduur van het enzym kunnen worden verlengd, wat een grotere productiviteit mogelijk maakt. Door al deze benaderingen te combineren, zou de efficiëntie waarschijnlijk met een factor tien toenemen.’