Zoeken en niet vinden. Dat is ook een waardevol resultaat. Utrechtse onderzoekers laten in Nature Methods zien dat een belangrijk reguleringsmechanisme bij bacteriën toch niet voorkomt bij mensen. ‘We werden steeds sceptischer.’  

Fosforylering, het koppelen van een fosfaatgroep aan een aminozuur, kan eiwitten activeren of remmen. Het bekende tumoronderdrukkende eiwit P53 bevat bijvoorbeeld 18 verschillende fosforyleringssites die de werking sturen. Aminozuren met een vrije hydroxylgroep, zoals serine (Ser), threonine (Thr) en tyrosine (Tyr), ondergaan vaak fosforylering. Het kan echter ook op histidine (His). Dan komt de fosfaatgroep op de imidazoolring; dat is een stuk zeldzamer. En dus moeilijker aan te tonen.  

Vijf jaar geleden ging promovendus Niels Leijten bij de Utrechtse groep van universitair hoofddocent Simone Lemeer aan de slag om uit te zoeken welke histidines in menselijke eiwitten zo’n een fosfaatgroep opgeplakt krijgen. In Utrecht was namelijk al met succes een analysemethode ontwikkeld om vast te stellen welke histidines gefosforyleerd worden in bacteriële cellen. Onderzoek bij mensen leek een logisch vervolg. Wel een stuk complexer, want een menselijke cel telt geen tweeduizend eiwitten, maar tien keer zoveel. Het was, kortom, zoeken naar de spreekwoordelijke spelden in een hooiberg. Dat bleek ook in de praktijk het geval. Het speurwerk naar gefosforyleerde histidine (pHis) verliep moeizaam. Lemeer en Leijten vonden namelijk telkens …. niets. Lemeer: ‘Eerst denk je dat er iets misgaat. Je probeert het opnieuw, checkt elke stap driedubbel. Maar al snel werden we sceptisch over het voorkomen bij de mens. We zagen gewoon geen histidine-fosforylering.’ 

‘Eerst denk je dat er iets misgaat’ 

Puzzelen

De zoektocht naar pHis begint met het enzymatisch opknippen van alle eiwitten in een cel tot een mix van peptiden, elk zo’n 10-15 aminozuren lang. Vervolgens wordt de kleine fractie gefosforyleerde peptiden eruit gevist. Dat gebeurt op een kolom met ijzerionen (IMAC). Ze worden daarna met vloeistofchromatografie één voor één de massaspectrometer ingestuurd. De totale massa van elk peptide wordt gemeten waarna het peptide wordt gefragmenteerd en ook de massa van de brokstukken wordt bepaald. Lemeer: ‘De crux is om van elk peptide genoeg verschillende fragmenten te genereren, dat doen we via higher energy collisional dissociation. Die fragmenten heb je nodig om uit te pluizen van welk eiwit het peptide afkomstig is en waar de fosfaatgroep precies zit.’ Een zoekmachine vergelijkt vervolgens de fragmenten met humane eiwitten in een enorme database en puzzelt het mogelijke peptide in elkaar. In eerste instantie wees het algoritme zo’n tweehonderd histidines in humane eiwitten aan als gefosforyleerd. ‘Maar de uitkomsten moet je kritisch bekijken’, zegt Lemeer. Want de puzzel kan ook fout worden gelegd. 

Ping-pong 

Een sterke aanwijzing voor een foutje in de puzzel kwam uit aangezuurde monsters. pHis is labiel bij lage pH. Bij MS-analyses van aangezuurde bacteriële monsters verdwenen inderdaad negen van de tien gevonden pHis’en, maar bij een aangezuurd humaan monster slechts de helft. Dat laatste komt eerder overeen met de stabiliteit van andere gefosforyleerde aminozuren; pSer of pTyr. Het vermoeden rees dat het algoritme pHis verwisselde met naastgelegen pSer, pThr of pTyr. 

Maar de ultieme doodsteek voor fosforylering van histidines in humane eiwitten volgde uit een vergeefse zoektocht naar het pHis-immonium ion. Dat ion is na het optimaliseren van de botsingsenergie te detecteren, zo bewezen de onderzoekers in bacteriën. In humane peptiden zagen Leijten en Lemeer het op slechts vier plekken in het proteoom opduiken. Van alle vier deze histidines is bekend dat ze kortstondig een fosfaatgroep kunnen dragen. Maar niet om cellulaire processen te reguleren. ‘Ze zijn betrokken bij een soort ping-pongmechanisme in bijvoorbeeld glycolyse’, vertelt Lemeer. ‘Dat we die wel aantroffen, bewijst hoe precies onze techniek is.’

Een aantal wetenschappers moet zich nu achter de oren krabben 

Calimero 

‘Geen speld tussen te krijgen’, reageert Francis Impens, hoofd van VIB Proteomics Core (Universiteit Gent) en niet betrokken bij het onderzoek. ‘Om eerdere vondsten te weerleggen moet een onderzoek natuurlijk stevig staan. In deze studie komen zeker een zevental experimenten tot dezelfde conclusie, mooi werk. Ook het ontbreken van genen bij de mens voor enzymen die de fosforylering zouden moeten katalyseren, onderschrijft het resultaat.’ 

Geen histidine-fosforylering in mensen dus. Maar waarom niet? ‘Een boeiende vraag’, aldus Lemeer. Maar ze kan enkel gissen. ‘Het is een wat labiel reguleringssysteem, misschien niet betrouwbaar genoeg?’ De groep vond inmiddels ook geen histidine-fosforylering bij muizen en eerste experimenten in zebravissen zijn ook negatief. Planten of insecten gaat Lemeer niet meer testen. ‘Ik ben meer geïnteresseerd in nieuwe vragen. Wat gebeurt er bijvoorbeeld in bacteriën als je histidine kinases blokkeert? Kan dit misschien leiden tot nieuwe antibiotica?’ 

Wereldwijd moet een aantal wetenschappers zich nu achter de oren krabben. Verschillende publicaties, waaronder in Nature, wezen namelijk eerder op histidine-fosforylering die humane stofwisselingsprocessen reguleert. Lemeer: ‘Het bewijs berust vaak op onderzoek met antilichamen, die blijken echt niet specifiek genoeg.’ De eigen publicatie in Nature Methods maakt Lemeer trots. ‘Het geeft een soort calimero-gevoel om met een klein clubje een vrij algemene aanname te weerleggen.’ 

Niels Leijten, Albert Heck, Simone Lemeer, Histidine phosphorylation in human cells; a needle of a phantom in the haystack?, Nature Methods (2020)