phi29 polymerase in actie.

In Canada is een diagnostische test voor uiteenlopende pathogenen ontwikkeld die 10.000 keer gevoeliger zou moeten zijn dan de huidige. Kwestie van handig hergebruik van een natuurlijk DNA-replicatiemechanisme, blijkt uit een publicatie in Angewandte Chemie.

De uitvinding van Yingfu Li en collega’s is geleend van phi29, een bacteriofaag die parasiteert op Bacillus subtilis. Zoals de meeste bacteriofagen maakt deze soort gebruik van rolling circle amplification (RCA) om snel grote aantallen kopieën van zijn ringvormige DNA te maken.

Daarvoor gebruikt hij het enzym phi29 DNA polymerase (phi29DP) dat twee eiwitdomeinen heeft met verschillende functies: het ene is het eigenlijke polymerase dat enkelstrengs DNA kopieert, het andere werkt als exonuclease dat nucleotiden één voor één van dat DNA afknipt. kan er aan het uiteinde nucleotiden van af knippen. Dat laatste werkt óók alleen met enkelstrengs DNA.

Het idee is nu om phi29DP een DNA-fragment te ‘voeren’ dat het pas kan kopiëren zodra het gezochte pathogeen aanwezig is. Dat pathogeen (preciezer: een eiwitfragment of een ander signaalmolecuul dat specifiek voor dat pathogeen is) wordt herkend door een zogeheten aptameer, een kort stuk DNA waarvan de basenvolgorde zo is gekozen dat het er qua 3D-vorm precies op past.

Aan dat aptameer wordt de te kopiëren DNA-ring gehangen, en een ‘pre-primer’ die het kopiëren kan inleiden zodra er een paar nucleotiden van af worden geknipt. De hele constructie zit zo in elkaar dat het DNA zichzelf dubbelvouwt zodat het exonuclease-deel van phi29DP er niet bij kan.

Maar als het aptameer zijn doelmolecuul ‘vangt’, dan veroorzaakt dat een structuurwijziging die het uiteinde van de preprimer vrij maakt. Op dat moment begint het exonuclease te knippen, zodat die preprimer verandert in een échte primer. Die wordt herkend door het polymerase, dat als een idioot de DNA-ring begint te kopiëren - en zo’n groot aantal kopieën is heel gemakkelijk detecteerbaar.

Het leuke is uiteraard dat je dit mechanisme kunt gebruiken voor elk doelmolecuul waar je een passend aptameer voor kunt vinden - en meestal vind je zo’n aptameer vanzelf. Naast fragmenten van bacteriën zou je er ook viraal DNA mee moeten kunnen herkennen, en zelfs biomarkers die specifiek zijn voor bepaalde vormen van kanker.

De Canadezen werken nu aan papieren teststrookjes waarin deze tests verwerkt zitten. Als een huisarts dan een vermoeden heeft van de kwaal waaraan een patiënt lijdt, kan hij zo’n strookje gebruiken om dat vermoeden nog tijdens het spreekuur te bevestigen.

bron: McMaster University