De Brusselse hoogleraar Jan Steyaert had de toegevoegde waarde van nanobodies in de structurele biologie al snel door. ‘Het is dé tool om eiwitten in een relevante conformatie te bevriezen.’

Op de campus van de Vrije Universiteit Brussel (VUB) treft C2W Jan Steyaert (53) voor een gesprek over ‘zijn’ onderwerp nanobodies. Steyaert is al nagenoeg zijn hele wetenschappelijk leven verbonden aan deze universiteit, die grondlegger is van wat je ‘alternatieve’ antilichamen zou kunnen noemen. Senior scientist Els Pardon, die al jaren nauw betrokken is bij dit onderzoek, schuift aan tijdens dit ontspannen wetenschappelijke onderhoud. De groep van het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB) van Steyaert draait om structurele biologie; de structuur van biologische macromoleculen bepalen tot op atomair niveau om zo de functie van een systeem te ontrafelen. Met in het geval van Steyaert en Pardon nanobodies. Zij gebruiken ze niet als antilichaam, maar als gereedschap om eiwitten in een gewenste conformatie vast te zetten.

Hoe ben je op nanobodies gestuit?

‘Sinds de ontdekking in 1994 heb ik er dicht op gezeten. En ik was meteen gefascineerd. Vanaf het begin zag ik opportuniteiten om nanobodies toe te passen in de structurele biologie, maar de focus lag vooral op de meer conventionele toepassingen aan antilichamen. Ik heb het meermaals als idee geopperd, maar het werd niet opgepikt. Toentertijd was ik actief in de enzymologie en zo’n tien jaar geleden gaf ik mijn onderzoek een compleet nieuwe wending om voluit in te zetten op nanobodies in de structurele biologie.’

Wat is het nut ervan in jouw vakgebied?

‘Vele jaren hebben we eiwitten als iets stars beschouwd, maar dat is niet zo. Beweging is er essentieel in. De vraag was dus of je eiwitten in verschillende conformaties kunt bevriezen en daarvan de structuur kunt bepalen, om zo een volledig beeld te creëren. We wilden nanobodies als tool ontwikkelen om eiwitten in die conformaties vast te zetten.’

Pardon: ‘Nanobodies spelen niet enkel een rol bij conformaties bevriezen. Ze bevorderen ook de kristalliseerbaarheid van eiwitten door de homogeniteit te verhogen. Door­-

gaans is dat toch een trade-off tussen een voldoende hoge concentratie en de vorming van aggregaten, waardoor het geheel neerslaat of uitkristalliseert.’

Hoe maak je zulke nanobodies?

‘Dat is te vergelijken met hoe je kinderen vaccineert. Je spuit het eiwit in een zo optimaal mogelijke conformatie in een lama en die gaat vervolgens antilichamen produceren. Die antilichamen herkennen en stabiliseren elk een specifieke conformatie van het ingespoten eiwit.’

Pardon: ‘Dat betekent niet dat je direct de juiste nanobody in handen hebt. Elk experiment begin je met een reeks nanobodies met verschillende eigenschappen. Vervol­gens kijk je, bijvoorbeeld met elektronenmicroscopie, welke daarvan het systeem zo rigide mogelijk vastzet in de gewenste conformatie. Die nanobody is dan het meest geschikt als tool voor kristallisatie.’

Nanobodies produceren vergt wel degelijk denkwerk

Is het echt zo simpel?

‘Er komt elke keer een inventieve stap bij kijken. We werken onder meer aan GPCR’s (G-eiwitgekoppelde receptoren, red.). Zo wisten we dat het complex van een receptor en zijn G-eiwit niet stabiel is en direct uit elkaar valt als we dit inspuiten in een lama. Daarom hebben we het chemisch ‘gecrosslinkt’. Met dat gestabiliseerde complex hebben het dier geïmmuniseerd. Vervolgens screenden we de antilichamen individueel op welke wél aan het complex bindt, maar niet aan de samengestelde delen. Zo genereerden we unieke antilichamen die het complex kunnen herkennen en stabiliseren. Nanobodies produceren vergt dus wel degelijk denkwerk, anders zou het ook niet leuk zijn.’

Pardon: ‘Sinds 2014 stelt ons lab nanobodies ook beschikbaar aan andere Europese onderzoekers, dat gaat via Instruct. Wij benadrukken trouwens elke keer dat je er met een goede technologie nog niet bent. Ook moet je je eiwitten goed zuiveren en de biochemie door en door kennen. Anders krijg je slechte antilichamen en leer je weinig.’

Hoeveel conformaties moet je meten voordat je de dynamische structuur kent?

‘Om het veld te overtuigen van de kracht van nanobodies kozen we de GPCR’s als proof of principle, omdat in die eiwitfamilie honderden targets voor drug discovery zitten. Iedereen wist dat GPCR’s werken als schakelaar, maar niemand wist hoe. Werkt zo’n receptor als schakelaar met twee standen, aan of uit, of werkt die als een continue dimmer?

Dankzij onze nanobodies zitten we voor GPCR’s nu aan minstens drie verschillende functionele conformaties waarmee we al veel van de biologie kunnen verklaren. We leerden trouwens dat veel eiwitten verschillende conformaties aangaan. Welke conformatie linkt aan welke biologische functie blijft echter vaak een open vraag. Dat was meteen onze grootste motivatie om deze tools te ontwikkelen.’

Daar kwam de latere Nobelprijs­winnaar Brian Kobilka om de hoek kijken.

‘Acht, negen jaar geleden gingen we samenwerken aan de β2-adrenoreceptor (β2AR, red.), de receptor voor adrenaline. Wij maakten nanobodies die deze receptor enkel bonden in zijn aan-toestand. Adrena­line is het natuurlijke hormoon dat de receptor aanzet, maar zelf kent het een matige affiniteit. Daarom kozen we voor een molecuul, gesynthetiseerd door het farmaceutische bedrijf Boehringer Ingelheim, met een vergelijkbare werking maar met een hogere affiniteit en langere bindingstijd. Uiteindelijk bepaalden we de structuur van β2AR met het BI-compound en onze nanobody. Omdat die aan de nanobody bond, wisten we dat we met de aan-toestand te maken hadden. Daarop konden we de aan- en uit-toestand van de receptor vergelijken.’

Wat maakte dit werk Nobelprijs­waardig?

‘De grote doorbraak kwam toen we ontdekten dat verschillende receptoren uit de GPCR-klasse, naast β2AR ook M2R, μOR en US28, op dezelfde manier schakelen. Bovendien leerden we hoe het G-eiwit dit signaal doorgeeft aan de binnenkant van de cel. Dat was een fundamentele ontdekking waarvoor Kobilka in 2012 de Nobelprijs ontving. Wij hebben het als startpunt genomen voor onze spin-off Confo Therapeutics. Met nanobodies brengen we eiwitten/receptoren in hun actieve toestand en vervolgens synthetiseren we small molecules die deze targets activeren. Zodoende hopen we nieuwe medicijnen te vinden. De markt voor geneesmiddelen die de adrenalinereceptor activeren is al verzadigd, daarom focust Confo Therapeutics op targets die inhaken op problemen rond bijvoorbeeld obesitas.’

Het entrepreneurship zit in ons bloed

Hecht je waarde aan valoriseren?

‘Zelf geloof ik minder in gericht toegepast onderzoek. De grootste ontdekkingen en doorbraken zijn het gevolg van fundamenteel onderzoek gestuurd door de nieuwsgierigheid van de onderzoeker. Zo ook de nanobodies. Maar bijna al ons fundamenteel wetenschappelijk onderzoek krijgt sponsoring van belastinggeld. Ik beschouw het dan ook als mijn opdracht om maatschappelijk relevante vindingen om te zetten in bruikbare producten. Al te vaak worden kansen gemist en wordt kennis gratis weggegeven aan de industrie.

Het is dus zaak om eerst IP aan te vragen. In die geest octrooieren we sinds 2010 ons werk. Zo hebben we een aantal octrooien genomen op de inzet van nanobodies om GPCR’s in actieve toestand te bevriezen. En ten grondslag aan Confo Therapeutics

ligt de technologie om small molecules te screenen. Het entrepreneurship zit in ons bloed en onze dubbele affiliatie met het VIB heeft hier in grote mate toe bijgedragen.’

Vanuit je groep ontstonden Ablynx (2001), AgroSavfe (2013) en Confo Therapeutics (2015). Menig wetenschapper zou jaloers zijn op zo’n lijst. Hoe kijk je tegen deze ontwikkelingen aan?

‘Ablynx en AgroSavfe wil ik zeker niet persoonlijk claimen, maar we hebben via deze dossiers wel leren ondernemen. Confo Therapeutics mag je voluit op conto van Els, Toon Laeremans en mijzelf schrijven. Die spin-off bevindt zich trouwens nog steeds op onze afdeling. We begonnen met vier mensen en nu werken er tien of elf. Zelf blijf ik als adviseur betrokken.

Wat ik vooral geleerd heb van de eerste twee bedrijven is wat je níet moet doen en/of verwachten. Mensen willen én startkapitaal én 100 % de baas blijven, maar zo werkt het niet. Je hebt op dag één zo veel geld nodig dat je meteen ook de controle kwijt bent. Het is vooral een mindset. Je moet eerst zelf veel tijd en energie investeren om een bedrijf op te starten om het vervolgens meteen weer uit handen te geven. Zo kostte het bij Confo Therapeutics zeker drie jaar om tot een goed businessplan te komen en de nodige investeerders te overtuigen.’

Wat trekt je het meest in het onder­nemerschap?

‘Het boeiendste vind ik nog steeds om een klein idee te zien uitgroeien tot een bedrijf waar een paar honderd mensen werken. En dat is toch wat Ablynx is. Met zo’n bedrijf toont de universiteit haar sociaal maatschappelijke meerwaarde. En bijdragen aan maatschappelijke relevantie is toch doorgaans moeilijk aantoonbaar als fundamenteel onderzoeker.’

Waar focus je nu op in je lab?

‘We hebben onze aandacht verlegd naar ionkanalen. Die zijn vergelijkbaar met GPCR’s, in de zin dat ze open of dicht kunnen staan. Ze zijn zeer interessant met oog op de ontwikkeling van pijnstillers, omdat bij veel van de signalen tussen neuronen ionkanalen betrokken zijn.

Verder kijken we naar eiwit-eiwitinteracties. We hebben tien-, twintigduizend eiwitten waarmee we heel ons lichaam opbouwen. Maar de uiteindelijke complexiteit is veel groter, omdat al die eiwitten samenwerken. De schatting is dat er zo’n twee-, driehonderdduizend van zulke complexen relevant zijn voor wat wij leven noemen. Kunnen we meer zicht krijgen op de aard van die interacties? We weten nog te weinig. Hoe interageren ze met elkaar, vormen ze complexen? Dit is de volgende stap in complexiteit waarop we een antwoord willen bieden. We werken nu aan een proof of concept.’

En dat begint weer met de ontwikkeling van een technologieplatform?

‘Klopt. De nanobodies vormen elke keer het startpunt. We vullen nu de gap van wilde ideeën om dit probleem aan te pakken naar iets dat werkt in de reageerbuis.’