Lang was supercritical fluid chromatography voorbehouden aan chirale scheidingen. Maar door een verbeterde robuustheid vindt de techniek meer en meer haar draai in andere toepassingen.

‘Wanneer klanten met slechte ervaringen met supercritical fluid chromatography (SFC, red.) in het verleden nu bij mij aankloppen en de performance van het nieuwste systeem zien, worden ze echt van hun sokken geblazen’, vertelt Isabelle François, business development manager UPC2/SFC bij Waters. ‘De technologie is de laatste vijf jaar namelijk zo veel robuuster geworden. Samen met de voordelen van snelle analyse, lage kosten en een groen tintje kun je wel stellen dat SFC aan populariteit wint en in steeds meer gebieden toepassing vindt.’ Zou de techniek zelfs de klassieke vloeistofchromatografie het vuur aan de schenen kunnen leggen?

‘In superkritisch koolstofdioxide is de diffusie veel sneller’

De werkwijze van SFC is bijna identiek aan die van HPLC. Je injecteert een monster en brengt het via de mobiele fase over naar een kolom gepakt met een stationaire fase die bestaat uit fijne deeltjes. De individuele componenten in het monster verschillen in interactie en affiniteit met de kolomdeeltjes, en elueren hierdoor op verschillende retentietijden.

Het verschil met HPLC zit in de mobiele fase. Hiervoor gebruik je bij SFC een superkritische vloeistof, meestal koolstofdioxide. Dat houd je onder een druk van minstens 74 bar en 32 °C. Het gedraagt zich dan als een stof tussen gas en vloeistof in.

Voordelen te over

Die superkritische toestand maakt dat koolstofdioxide een bijzonder goede mobiele fase vormt. ‘In superkritisch koolstofdioxide is de diffusie veel sneller, waardoor de opgeloste stoffen veel makkelijker bewegen’, zegt Ken Broeckhoven van de onderzoeksgroep chemical engineering van de Vrije Universiteit Brussel. Volgens Broeckhoven is SFC met zuiver koolstofdioxide als mobiele fase daardoor een factor tien sneller dan HPLC. Maar in de praktijk kun je hiermee maar weinig stoffen scheiden, vanwege de slechte oplosbaarheid in de mobiele fase. Vaak voeg je dus een organisch solvent toe, zoals methanol. Maar dan nog is de techniek zo’n drie tot vijf keer sneller, weet Broeckhoven.

‘In dezelfde tijd en flowrate heb je minder afval’

Een bijkomend voordeel is dat de mobiele fase een veel lagere viscositeit heeft dan die in HPLC, waardoor er minder wrijving ontstaat. ‘Daardoor kun je bij hogere flowrate werken, kan de kolom langer zijn en kunnen de deeltjes in de kolom kleiner zijn. Dit alles geeft een betere scheiding en dus resolutie’, vertelt Broeckhoven.

Ook op het gebied van milieuvriendelijkheid scoort SFC goed. ‘In de klassieke vloeistofchromatografie produceer je in een run van 1.000 minuten 1 l afval. Vaak bestaat dit afval deels uit acetonitril, een giftig goedje. Bij SFC bestaat 80 tot 90 % uit koolstofdioxide (de rest meestal uit methanol, red.). Dit verdampt of je recupereert het in het geval van een preparatieve scheiding. Je hebt dan dus in dezelfde tijd en met dezelfde flowsnelheid maar 100 tot 200 ml afval, dat ook nog eens minder giftig is’, vertelt Broeckhoven. En omdat de analysetijden korter zijn, produceer je per run minder afval.

Tot slot is SFC kostentechnisch een goede keuze. Omdat koolstofdioxide al langer bekend is in de voedsel- en drankindustrie ligt de infrastructuur klaar en kun je gasflessen goedkoop aanschaffen. Daarnaast is methanol aanzienlijk minder duur dan acetonitril.

Robuuster

Natuurlijk kent SFC ook nadelen. Vooral de lage robuustheid speelde de techniek lange tijd parten, veroorzaakt door expansie en inkrimping van de mobiele fase. Broeckhoven legt uit: ‘Bij vloeistofchromatografie heb je te maken met een weinig samendrukbare mobiele fase. Daardoor krijg je gaandeweg in de kolom opwarming door de wrijving tegen de kolomdeeltjes.’ In SFC daarentegen is er sprake van een meer gasachtige mobiele fase die kan expanderen. ‘Daardoor krijg je richting het einde van de kolom afkoeling.’

Als je naar hogere drukken gaat en meer methanol gaat toevoegen, krijg je op een gegeven moment zowel opwarming als afkoeling. Oftewel, je krijgt expansie én inkrimping van de mobiele fase op sommige plekken. Broeck­hoven: ‘Dit is geen probleem als je de kolom in een stabiele methode laat draaien, maar als je condities gaat wijzingen, zoals een langere kolom of een hogere flowrate, kun je last krijgen van variabele retentietijden.’

De laatste vijf jaar zijn de ontwikkelingen op het gebied van SFC hard gegaan en lijkt dit probleem steeds minder te spelen. Het nieuwste systeem van Waters, het UPC2-systeem, droeg daaraan eveneens bij, aldus François. ‘Wij koelen de pompkop, waardoor het binnenkomende koolstofdioxide altijd exact dezelfde temperatuur heeft. Ook heeft het systeem in plaats van een gewone backpressure regulator een zogenoemde dual-stage backpressure regulator, om zo goed te kunnen inspelen op de druk- en de temperatuurveranderingen die inherent zijn aan het uitvoeren van gradiëntmethodes.’

Eiwitten elueren

Hoewel SFC veel voordelen kent ten opzichte van HPLC, kun je niet alle scheidingen van HPLC ook met SFC doen. Als vuistregel kun je stellen dat elke stof die oplosbaar is in methanol of een minder polair oplosmiddel een goede kandidaat is voor SFC. Stoffen die je bijzonder goed met SFC kunt scheiden zijn enantiomeren. Chirale SFC-scheidingen gebeuren nu al zo’n tien jaar in de farmaceutische industrie.

‘Mijn tenen gaan haast krullen bij sommige toepassingen’

Verbindingen die waterige, gebufferde oplossingen vereisen, zouden zich bijvoorbeeld niet lenen voor scheiding met SFC, zo was de gedachte. Frederic Lynen van de onderzoeksgroep scheidingstechnieken van de Universiteit Gent zegt een verandering te zien. ‘Vroeger was SFC alleen voor vetachtige stoffen. Nu zie ik dat onderzoekers zelfs geladen componenten en gemodificeerde suikers gaan analysen met SFC. Daarvoor heb je in sommige gevallen dan wel C18-kolommen nodig, oftewel reversed phase in plaats van het in SFC gebruikelijker normal phase. Met die kolommen kun je zelfs zware biologische stalen, als urine en bloed, analyseren.’

De literatuur beschrijft zelfs de analyse van eiwitten. Maar dat vindt François een belediging van de techniek. ‘Mijn tenen gaan haast krullen als ik sommige toepassingen lees van SFC waarbij je tot wel 80 % methanol gebruikt in de mobiele fase om de beoogde moleculen te laten elueren. Dan spreek je niet meer over SFC, maar eerder over vloeistofchromatografie met enhanced fluidity. Nee, ik denk dat als een techniek als vloeistofchromatografie goed in staat is peptides en eiwitten te analyseren, waarom dan per se SFC? Je wilt bij een probleem toch zo snel mogelijk naar een oplossing, en dan wel de juiste oplossing?’