Vloeistofchromatografie (LC) van eiwitten kan soms lastig zijn vanwege hun dispersie. Een gloednieuwe techniek uit Brussel en Twente biedt een oplossing. Laterale vortices, opgewekt via wisselende elektrische velden, kunnen de doorstroming flink verbeteren.

Wim De Malsche

Wim De Malsche

Terwijl deeltjes zich door de LC-kolom bewegen, verspreiden ze zich steeds meer. Dit heet dispersie. Het belangrijkste type daarvan is Taylor-Aris-dispersie. ‘Bij dit fenomeen gaan analyten in het midden van het kanaal sneller dan aan de wand’, verklaart hoogleraar Wim De Malsche van de µFlow-groep van de Vrije Universiteit Brussel (VUB). ‘Dat komt doordat ze aan de zijkanten als het ware blijven plakken. Het gevolg is meer verdunning, waardoor de bandbreedte van de pieken toeneemt. Dat beperkt de uiteindelijke resolutie.’ Dit probleem speelt vooral bij intacte eiwitten en andere grote biomoleculen, omdat ze een trage diffusie-coëfficiënt hebben.

Lateraal mengen

De Malsche startte enkele jaren geleden met de VUB-spin-off PharmaFluidics. Centraal stond een nieuwe kolombepakking die tijdens LC de mate van wanorde, een andere vorm van dispersie, aanpakt. Dit keer besloten hij en zijn team (in samenwerking met onder meer hoogleraar Jan Eijkel van de Universiteit Twente) een oplossing uit te werken voor de Taylor-Aris-dispersie, waarbij actieve manipulatie van de vloeistof nodig is. ‘De truc bleek om loodrecht op de stroomrichting, dus lateraal, te gaan mengen’, vertelt De Malsche.

‘Wij zijn de enigen in de wereld die zich hiermee bezighouden’

In detail werkt dat als volgt. In de wanden van de micro-LC-kolom zijn elektroden geïntegreerd. De plus- en minpolen wisselen continu. Daardoor ontstaat een zogenaamde elektro-osmotische flow. ‘Stel nu dat op een bepaald moment de wand positief is geladen’, legt De Malsche uit. ‘Dan gaan de negatieve ionen in de vloeistof daaraan ‘plakken’. Vervolgens wordt de wand negatief en schieten ze weer los richting het midden. Steeds weer gaan ze heen en weer en door de voortbeweging in het kanaal ontstaat er dan laterale vortices.’ Dit gerichte mengen zorgt ervoor dat de staal minder verdunt.

Filip Legein

Filip Legein

Dat deze vortex-chromatografie werkt, blijkt uit testen met relatief grote moleculen, zoals dextraan. Als je er een plugje met deze moleculen doorheen stuurt, blijft dat plugje smaller. De zogenaamde plaathoogte (zie kader) blijft lager en daarmee ook de resolutie. Of om preciezer te zijn, zoals De Malsche verklaart: ‘Door de sterk verzwakte relatie tussen flowsnelheid en dispersie is er nu perspectief om 3 tot 5 maal sneller te stromen en te analyseren, met een gelijkaardige resolutie. Of omgekeerd: als je het debiet onveranderd houdt, dan kan de analyse met een veel hogere resolutie.’

Glasachtige systemen

De µFlow-groep kan nu geavanceerdere scheidingen uitvoeren. Daar zijn ook complexere systemen voor nodig. ‘Het grote verschil met conventionele chip-LC is dat wij vanwege de elektrische velden met isolatoren moeten werken, waardoor het populaire en conventionele silicium-substraat niet geschikt is’, zegt De Malsche. ‘Je wilt tenslotte geen geleiding dwars door je systeem hebben, want dan valt de laterale vloeistofstroom stil. We gaan we nu meer richting glasachtige systemen. Hierdoor is er weer nood aan de ontwikkeling van totaal nieuwe fabricagemethodes.’

Een interessant aspect is dat de techniek gemakkelijk miniaturiseerbaar is. De Malsche: ‘Dit geldt voor zowel kolom als elektroden, detectie en randapparatuur. Dat biedt een groot voordeel ten opzichte van grote klassieke chromatografiekolommen, die onder gigantische druk werken.’

De techniek is gemakkelijk miniaturiseerbaar

Er is dan ook volop interesse voor de nieuwe techniek. Het team heeft dit jaar een grote Europese subsidie binnengehaald. Een van de speerpunten van het project is samenwerking met het Universitair Ziekenhuis Centrum Brussel. ‘We willen helpen bij de diagnose van diabetes’, vertelt Filip Legein, business development manager van de µFlow-groep van De Malsche. ‘Bloedanalyse richt zich nu soms op specifieke geglycosileerde hemoglobinen. Maar bepaalde genetische varianten kun je soms moeilijk van elkaar onderscheiden. Daardoor is de ziekte bij patiënten met bepaalde etnische achtergronden niet altijd goed op te sporen, of kan de opvolging met medicatie niet kloppen. Wij denken dat vortex-chromatografie een steentje kan bijdragen aan het verbeteren van de bloedanalyse.’

De techniek staat nog in de kinderschoenen. Het vergt nog jaren onderzoek vooraleer het team nog maar denkt aan actieve commercialisatie. ‘Wij zijn de enigen in de wereld die zich hiermee bezighouden, dus we moeten alles zelf uitvogelen, en dat neemt zijn tijd’, zegt De Malsche. ‘Maar conceptueel zit het idee heel goed in elkaar, dus we weten wat er moet gaan gebeuren om het tot een succes te brengen.’

Vortex Van deemters

Vortex Van deemters

De Van Deemter-curve en laterale vortices

De Van Deemter-vergelijking wordt bij vloeistofchromatografie (LC) gebruikt om een verband aan te tonen tussen de flowsnelheid en de plaathoogte. De plaathoogte is een maat van de efficiëntie van de scheiding. Een van de vormen van dispersie die ontstaan in een kolom is de Taylor-Aris-dispersie. Deze vorm van dispersie kan worden beschreven met de volgende formule:

h = 2/v + 2K­­aris*v

Hierbij is h de dimensieloze plaathoogte, v de dimensieloze snelheid en K­­aris de dispersie-coëfficiënt. Je kunt de eerste parameter ook wel zien als de B-term van de klassieke zogeheten Van Deemter-vergelijking en de tweede parameter als de C-term.

Door nu met de nieuwe techniek laterale vortices te introduceren, zal de laterale massa-transfer toenemen, waardoor de Taylor-Aris-dispersie afneemt en daarmee Karis­. Het gevolg is dat dat plaathoogte afneemt en daarmee ook de bandbreedte van de pieken. Daardoor kun je analyten beter van elkaar onderscheiden.

In de getoonde grafiek is de elutiesnelheid uitgezet tegen de piekverbreding (als maat van h). Te zien is dat bij hogere flowsnelheid de bandbreedte veel minder toeneemt. Dit in tegenstelling tot conventionele chromatografie.