Stabiel-isotoop gelabelde referentie-eiwitten voor MS zijn lastig te maken. De oplossing is ervoor zorgen dat cellen gelabelde eiwitten produceren.

Theo Luider en collega’s van het Erasmus MC doen onderzoek naar kankercellen en hun meta­bolisme door met massaspectrometrie eiwitten te identificeren en te kwantificeren die bij die processen betrokken zijn. Voor die metingen zijn referentiematerialen nodig; standaardeiwitten die je aan het monster toevoegt waarmee je de eiwitproducten inclusief metabolieten in het monster kunt vergelijken.

Om een uitspraak te kunnen doen over de hoeveelheid eiwitten label je de standaarden met 13C of 15N. Daardoor verschuiven de signalen in het massaspectrogram 1 Dalton per gelabeld atoom. Het kost honderden euro’s per microgram om die referentie-eiwitten te maken. Per monster gaat het om duizenden eiwitten. ‘Je kunt je voorstellen dat dit een astronomisch bedrag is. Er is dus grote behoefte aan betere referenties’, zegt Luider.

Tatiana Egorova, ceo van het Leidse bedrijf Protein Labelling Innovation (PLI), ontwikkelt kosteneffectieve methodes om gelabelde referentiematerialen te maken. PLI kweekt verschillende celtypes waarin alle koolstofatomen vervangen zijn door 13C en stikstofatomen door 15N. ‘We gebruiken bijvoorbeeld gistcellen gelabeld met 13C of 15N om verschillende gelabelde eiwitten te maken. Gistextracten nemen we als voedingsstoffen om allerlei cellijnen te kweken met de bedoeling gelabeld biomateriaal te krijgen’, legt Egorova uit. Theo Luider voegt toe: ‘Het is synthetisch lastig om ge­labelde eiwitten grootschalig te maken. Biosynthese biedt een alternatief. In de gistcellen zijn alle verbindingen gelabeld, zodat je een veel simpelere en fraaiere manier hebt om referentiematerialen te maken.’

‘In de gistcellen zijn alle verbindingen gelabeld’

Met een KIEM-subsidie van NWO testen Luider en Egorova nu of het mogelijk is om een extract van de gelabelde gist te gebruiken als voedingsbodem voor HeLa-cellen, een standaardkankercellijn. ‘De cellen blijken hierop goed te groeien. We hopen nu HeLa-cellen te krijgen die voor 99 % gelabeld zijn met 13C’, vertelt Luider. ‘Dat moeten we nog vaststellen met LC-MS. Het aardige is dat de gelabelde en niet-gelabelde eiwitten chemisch identiek zijn. We kunnen ze dus gelijktijdig met LC identificeren, hoewel hun massa verschillend is. In het massaspectrogram verschuift het signaal 1 Dalton per koolstof-atoom. Het signaal kan dus wel tientallen Daltons verschoven zijn. Dat is een heel grote verschuiving.’

Bovendien zou de isotopenverdeling in de massaspectrogrammen verdwenen moeten zijn, aldus Luider. ‘In de natuur is een op de honderd C-atomen 13C, de rest is 12C. Normaal gesproken zie je met MS dus een kansverdeling van signalen. Die verdeling zijn we als het goed is kwijt. Ik ben benieuwd hoe dat eruit gaat zien.’

Goedkoop

Het belangrijkste voordeel van de isotoop-gelabelde cellen is dat de onderzoekers nu op een goedkope manier een volledig gelabeld referentiemateriaal in handen hebben. Luider: ‘Als dit werkt, hoeven we straks niet meer alle referentie-eiwitten apart te bestellen.’ Over enkele maanden moeten alle MS-experimenten afgerond zijn. Als blijkt dat je op die manier HeLa-cellen kunt labelen, wil Luider het gelabelde ­gistextract ook als nutriënt gebruiken om andere kankercellijnen te labelen.

Egorova is met name geïnteresseerd in nieuwe toepassingen ontwikkelen voor haar gelabelde materialen. ‘Het KIEM-project biedt mogelijkheden om dat voor de combinatie met massaspectrometrie verder te ontwikkelen. Dat is voor PLI een reden om te investeren in dit project en om de octrooilicentie ter beschikking te stellen.’