“We hebben de afgelopen 2 jaar ongeveer tien eiwitten in hersenvocht gevonden die betrokken zijn bij MS”, zegt onderzoeksleider Theo Luider, hoofd van het laboratorium Neuro-Oncology & Clinical and Cancer Proteomics op het Erasmus MC in Rotterdam. Dat is bijzonder, want tot op heden was de detectie van de auto-immuunziekte multiple sclerose (MS) ronduit gebrekkig.

Nu tonen ziekenhuizen MS nog aan door te kijken of er overmatig veel antilichamen in het hersenvocht voorkomen, wat erop duidt dat het immuunsysteem inderdaad op hol is geslagen. Maar die grote hoeveelheden kunnen ook op een ontsteking of een andere auto-immuunziekte wijzen. De eiwitten van het Erasmus MC zouden meer diagnostische waarde moeten hebben.

Dat het al mogelijk is om in hersenvocht eiwitten met diagnostische waarde voor hersenziektes te vinden toont de vondst in ieder geval aan. Dat is niet zo vanzelfsprekend, want onderzoek naar eiwitten in hersenvloeistof is nog een stuk lastiger dan in bloed of urine. Van hersenvloeistof krijgen laboratoria namelijk maar minieme hoeveelheden binnen. Vaak wordt maar 5 ml afgenomen, omdat mensen slechts 150 ml hersenvocht hebben, terwijl ze wel 6 l bloed bezitten. Bovendien wordt hersenvocht in Nederland alleen afgenomen als het echt nodig is voor een diagnose. Dat komt omdat de zogeheten limbaalpunctie, waarbij met een holle naald tussen de lendenwervels hersenvocht wordt afgenomen, bij 1 tot 2 procent van de patiënten tot hoofdpijnklachten leidt.

STABIEL

“Voor het onderzoek krijgen we zelfs maar 2 ml of nog minder”, vertelt Therese Rosenling, die op de Rijksuniversiteit Groningen ook eiwitten met diagnostische waarde voor MS bestudeert. Juist vanwege die beperkte beschikbaarheid van hersenvloeistof onderzoekt Rosenling de eiwitten met zogeheten ChipLC-QTOF-MS, een in Rotterdam ontwikkelde technologie waarbij geautomatiseerde vloeistofchromatografie op nanoschaal is gekoppeld aan hoge resolutie massaspectrometrie. “Voor de normale maat chromatografiekolommen zouden we veel te weinig vloeistof hebben.”

Om de nieuwe technologie te valideren, bekijkt Rosenling hoe stabiel de eiwitten blijven gedurende het gehele onderzoekstraject na de limbaalpunctie. Dat traject begint bij het selecteren van de eiwitten die specifiek zijn voor hersenziektes als MS uit de honderden of misschien wel duizenden eiwitten in hersenvocht. Daarvoor verwijderen ze eerst de overheersende eiwitten zoals albumine. De andere eiwitten knippen ze in stukjes met trypsine, waarna ze deze met verschillende chromatografiestappen op hydrofobiciteit, lading en grootte van elkaar scheiden. De kneep zit hem echter in de miniaturisering van de gebruikte vloeistofchromatografie – de kolom heeft een breedte van slechts 75 µm en een lengte van 175 mm – en de inzet van specifieke massaspectrometers voor de identificatie en concentratiebepaling van de uiteindelijke eiwitten.

“We zetten achter de nanovloeistofchromatografiestappen meerdere typen massaspectrometers”, zegt Luider. Om de concentratie te bepalen gebruikt hij bijvoorbeeld een Triple Quadrupole MS. “Andere groepen in de wereld doen het weer anders. Dat is het leuke aan massaspectrometrie. Afhankelijk van hoe je monsters voorbewerkt en welke typen eiwitten je nader wilt identificeren of kwantificeren, kun je kiezen voor verschillende apparaten. Wil je bijvoorbeeld de kinases onderzoeken, dan gebruik je een massaspectrometer die specifiek geschikt is om gefosforyleerde peptiden te identificeren en kwantificeren.”

LAGE CONCENTRATIES

Vooral de lage concentraties eiwitten in hersenvocht zijn een probleem, vindt Marcel Verbeek, neurochemicus op de Radboud Universiteit Nijmegen. Hersenvocht wordt in het weefsel aan de rand van hersenventrikels gefilterd uit het bloedserum. “Serum ziet geel van de eiwitten, hersenvocht lijkt op water”, zo vergelijkt hij. “In hersenvocht komen alle eiwitten in 200 tot 500 keer lagere concentraties voor dan in bloed. Sommige eiwitten uit de hersenen komen wel in een hogere concentratie voor in het hersenvocht dan in bloed, maar zelfs dan zijn die concentraties erg laag.”

Verbeek kampt met dat probleem bij het verbeteren van de oude ELISA-test voor alzheimer. Bij die test worden nu drie eiwitten, twee tau-eiwitten en de mono meer van het amyloïd-bèta-eiwit, uit hersenvocht gedetecteerd door ze aan antilichamen te binden en de gebonden antilichamen vervolgens te kleuren. Als de concentratie tau-eiwitten in het hersenvocht van een dementerende patiënt hoger is dan normaal, terwijl de concentratie van het monomeer van het amyloïd-bèta-eiwit juist lager ligt, heb je een aanwijzing voor alzheimer. Maar de test biedt nog niet voldoende uitkomst; eenzelfde patroon vind je namelijk ook weleens bij andere vormen van dementie. De onderzoekers ontwikkelen nu samen met onder meer Schering-Plough (voorheen Organon) een test die kijkt naar de nog oplosbare oligomeren – korte ketens van de monomeren – van het amyloïd-bèta-eiwit. De eiwitten zijn dan al een beetje samengeklonterd tot de typerende plaques voor alzheimer. De concentraties van die oligomeren zijn alleen nog lager dan van de monomeren. Hoe detecteer je dat?

“Tot nog toe is het niet gelukt”, vertelt Verbeek. “Er is een grens aan wat je met ELISA nog kunt detecteren. In een traditionele ELISA bindt namelijk één antilichaam aan één doeleiwit. We willen deze detectie verbeteren door het anti lichaam te koppelen aan nanodeeltjes. Door vervolgens deze nanodeeltjes te detecteren waaraan het eiwit zit, verhogen we de gevoeligheid van de ELISA met maximaal een factor 200.”

DYNAMISCH

Ook concentratieverschillen bepalen in patiënten met en zonder de gezochte hersenaandoening is niet zo eenvoudig. Net als bloed is hersenvocht nogal dynamisch, legt Luider uit. De concentraties van eiwitten kunnen erg variabel zijn tussen mensen, maar ook bij dezelfde persoon verschillen deze in de tijd. Voor statistisch betrouwbare uitspraken zijn dus veel metingen en proefpersonen nodig.

De Rotterdamse onderzoekers hebben hun tien potentiële biomarkers voor MS gevonden in studies onder inmiddels tweehonderd patiënten met en zonder MS. Maar er zijn nog veel meer proefpersonen nodig. De onderzoekers hopen in nieuwe studies tot een selectie van vijf eiwitten te komen die de beste diagnostische waarde hebben om samen met de industrie een nieuwe ELISA-test te ontwikkelen. Ook die test moet weer klinisch worden gevalideerd voordat ziekenhuizen hem breed kunnen inzetten.

Toch lijkt hersenvocht – ondanks alle moeilijkheden – de aangewezen vloeistof voor biomarkers voor hersenaandoeningen. In bloed zitten herseneiwitten namelijk in nog lagere concentraties en met nog meer ‘ruis’ van andere eiwitten. Bovendien lijken de concentratieverschillen bij mensen met en zonder de hersenaandoening in hersenvocht groter en dus makkelijker te detecteren. Maar er is nog een hoop te doen, meent Nijmegenaar Luider. “Wereldwijd zijn nog maar een handjevol eiwitten – circa vijfhonderd – met massaspectrometers in hersenvocht gedetecteerd. En de eiwitten die wij hebben gevonden zijn nog niet geworteld in een biochemische route. We weten dus nog niet waarom ze in hogere of lagere concentraties bij MS-patiënten voorkomen.”

www.proteome.nl

Bron: C2W Life Sciences 7, 4 april 2009

Onderwerpen