De productie van biotechmedicijnen in celkweken heeft onverwacht grote sprongen gemaakt. De eiwitproductie per liter is veel hoger dan een aantal jaren geleden. Maar kan de zuiveringslijn met chromatografiekolommen de hogere expressieniveaus bijbenen?

De werkpaarden van de farmaceutische industrie zijn de afgelopen jaren flink harder gaan lopen. Was een eiwitexpressieniveau van 1 g/l een paar jaar geleden nog de limiet, nu zijn expressies van 5 g/l en hoger al haalbaar. “DSM en Crucell hebben zelfs al expressies van 10 tot 15 g/l aangekondigd”, vertelt Marc Bisschops, scientific director van biotechconsultant Xendo in Leiden en bestuurslid van de NBV-studiegroep Productisolatie en -zuivering.

Veel eiwit produceren in je fermentor is één ding, maar als je dat er vervolgens niet allemaal uit krijgt tijdens je zuiveringstappen heb je er weinig aan. De wedloop om de hoogste expressie­niveaus dreigt daarmee een lastig staartje te krijgen, want de zuiveringslijnen in bestaande fabrieken zijn niet eenvoudig op te schalen.

Pannenkoeken

Die huidige zuiveringslijnen, waarvan chromatografiekolommen een vast onderdeel zijn, zijn ontworpen met een eiwitexpressieniveau van slechts 1 g/l als uitgangspunt. En een chromatografiekolom heeft een vaste capaciteit; er zijn geen eenvoudige trucs om meer kilo’s in een bestaande kolom te binden. Bisschop: “Bij biotechbedrijf Lonza kon de chromatografieafdeling net 5 g/l opwerken. Het management wilde echter per se het expressieniveau verhogen, ondanks dat ze dan grote delen zouden moeten weggooien volgens de scheidingstechnologen.”

Vaak loont een extra chromatografiekolom plaatsen in de bestaande zuiveringslijn niet de moeite vanwege de beperkte ruimte en hoge kosten. Eiwitzuiveringskolommen nemen in een fabriek veel ruimte in, omdat ze qua vorm op pannenkoeken lijken. Ze zijn niet hoog, maar wel gauw 1 à 2 m breed. Die breedte beperkt de drukval: bij de hoge drukverschillen die ontstaan als je je vloeistof met eiwit door een lange kolom wilt persen zuiveren de samendrukbare kolombedden niet meer uniform.

Ook de prijs is een probleem. Die kan voor een scheidingsgel oplopen tot wel 150.000 euro per liter. “In een protein- A-kolom van 15 cm hoog en met een diameter van 2 m zit zo’n 400 liter hars à 10.000 euro per liter. Dan spreek je dus over ruim 4 miljoen euro”, aldus Bisschops.

Die prijs maakt volgens Bisschops ook opschaling door de kolom te vergroten minder aantrekkelijk. “Eigenlijk wil je vanwege risicobeheersing geen grotere kolommen. Operators zijn ook mensen, die kunnen af en toe een fout maken. Het is de ‘monoklonale nachtmerrie’ als je natronloog gooit over een megadure kolom die daar niet tegen kan.”

De aard van de industrie is dat er veel handwerk is en weinig standaardsystemen zijn. Het gaat om relatief kleine batches, bij epo bijvoorbeeld maar om enkele tientallen kilo's per jaar. “Hierdoor is het productieproces erg gevoelig voor fouten en dat stelt hoge eisen aan het personeel”, stelt Bisschops. “Daarom zijn de operators in de biofarma altijd hoogopgeleid. Als er iets misgaat, moeten ze de batch direct veilig kunnen stellen. Het verkrijgen van die hoogopgeleide werknemers is misschien nog wel het grootste probleem bij de zuivering van biofarmaceutica.”

Continue chromatografie

Ondanks alle problemen zitten de bioprocestechnologen toch aan chromatografie vast om hun eiwitten op te zuiveren. Purificatie via membranen of kristallisatie is vaak niet specifiek genoeg om je medicijn zuiver genoeg in handen te krijgen.

Tijd dus om de rigiditeit van de kolommen te verbeteren om sneller meer eiwit te isoleren. Ook de liganddichtheid in de kolom verhogen zorgt ervoor dat je meer eiwit uit je fermentatiemengsel kunt vissen. De eerste stappen daarvoor zijn al gezet. “Wij hebben harsen ontwikkeld die 100 à 150 in plaats van 30 à 40 mg eiwit per ml kunnen opzuiveren en die vrijwel onafhankelijk zijn van de vloeistofsnelheid”, vertelt François Geeraerts van kolommenproducent GE Healthcare. “Daarmee zijn ook de debieten met een factor 4 toegenomen. Koppel je de verhoogde capaciteit aan de snelheidstoename, dan blijkt dat chromatografie al een factor of 12 sneller is dan vroeger.”

Van origine kan de agarosematrix van een proteinA-kolom slecht tegen hoge druk. “De versnelling was mogelijk met een andere crosslinker en door het fabricage­procedé zo te optimaliseren dat de kolomdeeltjes een grootte van 90 µm kregen, met voldoende porositeit om veel materiaal te binden en star genoeg om een hoge vloeistofsnelheid te weerstaan zonder veel tegendruk te genereren.”

Een alternatieve technologie uit de suikerindustrie kan mogelijk ook soelaas bieden: continue chromatografie volgens de simulated moving bed-technologie (SMB). Daarmee is tot 20 procent aan hars te besparen doordat je minder dood volume hebt. “Bij SMB maak je gelijktijdig gebruik van meerdere kolommen in verschillende fases van het proces”, vertelt Jeroen den Hollander van DSM Food Innovations en bestuurslid van de NBV-studiegroep Productisolatie en -zuivering. “Door de kolommen te rouleren tussen verschillende vul- en wasstappen, heb je welhaast een continuproces en bevindt zich vrijwel geen leeg volume in de kolom. Zodoende benut je het hars zo volledig mogelijk. En ook verbruik je minder eluens om de kolom te wassen.”

Kolommenfabrikant Geeraerts betwijfelt of SMB überhaupt wel een optie is. “Ook in de farma en biotech is met SMB geëxperimenteerd, maar de toepassing van deze techniek om complexe eiwitmengsels te scheiden is verre van eenvoudig.”

Toch is Bisschops met Xendo juist bezig om SMB in de farmawereld te introduceren. “Een bestaand proces omschakelen naar SMB is vrijwel alleen een optie voor generieke geneesmiddelen waarop een lagere marge zit”, is zijn inschatting. Een echte marktintroductie kan volgens hem dus nog wel even duren. “We zijn nu bezig met een prototype, en veel gebruikers willen serieus testen. Zowel voor bestaande als voor nieuwe producten die nog niet geregistreerd zijn. Maar voordat zij op commerciële schaal wordt gebruikt, zijn we zo weer zeven jaar verder.”

Het kolommateriaal en de buffers veranderen bij SMB niet. Dat ziet Bisschops als voordeel in de traditionele farma-industrie. Ook is het daardoor voor bestaande medicijnen gemakkelijker om goedkeuring te krijgen voor de procesveranderingen van registratieorganen als de Amerikaanse FDA en Europese EMEA.

“Het hele zuiveringsproces is namelijk exact vastgelegd. Binnen die specificaties mag je spelen, anders moet het proces opnieuw worden gevalideerd”, licht Luc Kupers van Genzyme Flanders toe. Gebruik je ander kolommateriaal in een stap, dan moet je eerst op kleine schaal het effect op het volledige zuiveringsproces onderzoeken om daarna deze stap op productieschaal te valideren. Vervolgens moet ook de overheid de opschaling nog goedkeuren, een proces dat lang kan duren.”

Onzuiverheden

Die overheidsbemoeienis is volgens Kupers niet onnodig. “Het hele proces is zo gestandaardiseerd mogelijk, want ander kolommateriaal kan gevolgen hebben voor bijvoorbeeld de concentratie aan onzuiverheden, en dus voor de kwaliteit van het eindproduct.”

“Als we de processen beter wetenschappelijk leren begrijpen, kunnen kleine veranderingen in de productiemethode zonder tussenkomst van de overheid worden geregeld”, stelt Kupers. Alleen als je die kennis hebt, kun je aan de slag met process analytical technology-protocollen (PAT), waarbij het proces online wordt gemonitord, zodat het proces is bij te sturen zonder gevolgen voor de kwaliteit van het eindproduct.|

Bron: C2W life sciences 9, 2 mei 2008