Met infraroodspectroscopie in een massaspectrometer kun je de informatie van beide meettechnieken combineren. Vergelijk je het IR-spectrum dat dan ontstaat met DFT-berekeningen, dan kun je heel gericht de precieze molecuulstructuur van biomarkers ontrafelen.

pexels-rene-asmussen-325690

Beeld: Pexels

Bij pasgeboren kinderen wordt via de hielprik op allerlei biomarkers gescreend.

Bij de screening voor metabole ziektes en aandoeningen zoek je naar specifieke biomarkers die kunnen wijzen op een defecte stofwisselingsroute in het lichaam. Bij de metabole ziekte pyridoxine-afhankelijke epilepsie (PDE-ALDH7A1) is de l-lysine-pathway onderbroken door het niet goed functioneren van het enzym α-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase, ook wel antiquitine genoemd. Daardoor hopen zich α-aminoadipic semialdehyde (α-AASA), piperidine-6-carboxylaat (P6C) en andere stoffen op, waarbij P6C pyridoxaal-5’-fosfaat inhibeert en zo de opname van vitamine B6 remt. Dat heeft onder andere epileptische aanvallen tot gevolg en in veel gevallen ook een ontwikkelingsachterstand van de hersenen. Hoe eerder de diagnose, hoe beter de prognose voor mensen die deze aandoening hebben.

‘In plaats van afzonderlijk IR en MS te meten, gebruiken we infrarood-ionspectroscopie’

Nu is het probleem dat de metabolieten waar op wordt gescreend niet stabiel zijn. Onderzoekers van het Radboudumc en de Radboud Universiteit Nijmegen (RU) zochten daarom naar andere metabolieten die kunnen wijzen op PDE-ALDH7A1 in pasgeborenen. ‘De primaire metabolieten zijn wel bekend, maar die vind je niet terug in een sample, en zijn dus niet geschikt als biomarker’, vertelt Jos Oomens, hoogleraar molecular structure and dynamics aan de RU. ‘Bij onze vondst gaat het meer om een eindproduct en dat accumuleert dus wel.’ Dat maakt het mogelijk om op die stoffen te screenen, en daar is recent een techniek voor ontwikkeld: next-generation metabolic screening (NGMS).

Jos Oomens

Jos Oomens

‘NGMS is op het Radboudumc ontwikkeld, ontstaan vanuit de behoefte om nieuwe biomarkers te vinden bij verschillende metabole ziektes’, vervolgt Oomens. ‘De nog onbekende stoffen komen bij ons terecht.’ Het team van de Nijmeegse hoogleraar kijkt vervolgens met een combinatie van tandem massaspectrometrie (MS/MS) en infrarood- (IR) laserspectroscopie. ‘In plaats van afzonderlijk IR en MS te meten, gebruiken we infrarood-ionspectroscopie, ook wel IRIS genoemd. De dichtheid van ionen in een normale MS is namelijk veel te laag om absorptiespectroscopie op toe te passen, en IR op zichzelf is niet goed toepasbaar op individuele componenten in een complex mengsel.’

FELIX

De metingen doen ze met de vrije-elektronenlaser FELIX, die af te stemmen is op elke gewenste IR-golflengte. ‘We stoppen een patiënt-sample in de MS die het ioniseert en omzet in de gasvorm’, legt Oomens uit. ‘In de MS isoleren we de ionen van het gewenste molecuulgewicht en zenden dan de IR-laserstraal op zo’n ionenwolkje af, waardoor we een IR-spectrum krijgen dat gekoppeld is aan een specifieke massa.’

‘Omdat de metabole pathway bekend is, zijn de precursors ook bekend; dat maakte de puzzel wat makkelijker’

De collega’s aan het Radboudumc vonden in de lysine-pathway een verhoogde concentratie van een onbekende stof met een massa van 186 Da via NGMS: het eerste puzzelstukje. ‘Via MS/MS zagen we dat de onbekende stof afbreekt tot een massa van 128 Da, wat overeenkomt met P6C, een belangrijk molecuul in deze pathway; dat konden we bevestigen met IRIS’, zegt Oomens. Zo’n IRIS-spectrum kun je namelijk vergelijken met DFT-berekeningen, die aardig nauwkeurig een IR-spectrum van kleine moleculen voorspellen (zie afbeelding hieronder). Maar met die vondst waren ze er nog niet; wat is het molecuul achter de massa van 186 Da?

IRIS-spectrum

IRIS-spectrum

Beeld: Jos Oomens

De zwarte lijn is het gemeten IRIS-spectrum, het oranje gebied is het theoretische spectrum, gemeten met DFT-berekeningen.

Met een beetje puzzelen leek het massaverschil te suggereren dat P6C een extra C3H5O-groep had. Oomens: ‘Omdat de metabole pathway bekend is, zijn de precursors ook bekend. Dat maakte de puzzel wat makkelijker en het bracht de kandidaten terug tot tien à twintig stuks.’ Nadat ze een match hadden tussen het gemeten spectrum en de DFT-berekeningen, bleek dat het ging om twee diastereomeren van (6-(2-oxopropyl)piperidine-2-carboxylzuur met bijna dezelfde retentietijd.

‘We hebben toen onze synthese-collega’s van de groep van Floris Rutjes gevraagd en zij maakten de twee stereospecifieke moleculen.’ Met de twee referentiemoleculen konden Oomens en zijn groep vervolgens de spectra van de onbekende biomarkers met de referentiespectra vergelijken, en zo de molecuulstructuren definitief toewijzen.

L-lysine pathway

Beeld: Jos Oomens

Hier is de L-lysine pathway weergegeven. De oranje pijlen geven aan welke biomarkers accumuleren.

Screening van pasgeborenen

Het resultaat is aan de ene kant praktisch omdat het universitair ziekenhuis deze methode nu al kan inzetten voor de screening van pasgeborenen. ‘Precies zoals je de hielprik nu al gebruikt om op andere metabole ziektes te screenen’, licht Oomens toe. ‘Vroege detectie van PDE biedt patiënten een veel betere levensverwachting, je kunt veel eerder beginnen met een aangepast dieet.’

Aan de andere kant staat het academische resultaat. ‘Nu we deze moleculen hebben geïdentificeerd, kunnen we antwoord zoeken op de vraag: wat is de pathofysiologische werking van deze metabolieten? Zit hier een potentiële behandeling in?’ Daarnaast is nu ook het beeld van de metabole pathway van lysine completer. Oomens besluit: ‘Die samenwerking tussen het ziekenhuis en de verschillende universitaire groepen vind ik heel waardevol. Zonder samenwerking sta je nergens.’

Van Outersterp, R.E. et al. (2021) Anal. Chem. 93(46)
Engelke, U.F.H. et al. (2021) J. Clin. Invest. 131(15)

Bruker-Amazon-FELIX

Bruker-Amazon-FELIX

Beeld: Jos Oomens

Dit is het apparaat waarmee de groep van Jos Oomens de IRIS-metingen doet.

Het toepassingsgebied van IRIS

Infrarood-ionspectroscopie combineert de informatie die je uit massaspectrometrie (massa en elementaire samenstelling) en infraroodspectroscopie (moleculaire structuur) kunt halen. Hoewel IRIS nog redelijk veel handwerk is, kan het wel een oplossing bieden als NMR-metingen lastig zijn door bijvoorbeeld een te lage concentratie. ‘Deze techniek is net zo gevoelig als MS’, zegt Jos Oomens van de Radboud Universiteit. ‘Je kunt er dan wel geen biopolymeren mee bekijken, maar kleine moleculen met functionele groepen, zoals metabolieten en medicijnen, zijn zeer geschikt voor IRIS.’

Want naar de metabole routes van lichaamseigen stoffen kijken is niet het enige waar je IRIS voor kunt gebruiken. Zo kijkt Oomens met Janssen Pharma naar transformatieproducten van medicijnen. Oomens: ‘Welke moleculen ontstaan er als de lever een medicijn oxideert of afbreekt?’ Verder kun je ook kijken naar designer drugs. ‘Je kunt erachter komen of een methylgroep net een plek is verschoven, bijvoorbeeld bij de drug MMC. Door het DFT-spectrum over je gemeten spectrum te leggen, kun je het verschil zien tussen 2-MMC of 3-MMC.’ Een andere toepassing is het kijken naar afbraakproducten van aerosolen als α-pineen.

Er zijn nog wel wat uitdagingen. ‘Als je helemaal niet weet wat het molecuul kan zijn, bijvoorbeeld bij verontreinigingen in water, wordt het een lastig verhaal’, licht Oomens toe. ‘De kunst is om een goede workflow te vinden om de stoffen toch te identificeren.’ Je zou bijvoorbeeld kunnen denken aan machine learning of kunstmatige intelligentie. ‘Er zijn vele compound-bibliotheken met miljoenen entries. Daarmee moet je een behoorlijke start kunnen maken.’

 

EuroFAST 2022

Ieder jaar vindt de conferentie FAST plaats, wat staat voor Forum on Analytical Science and Technology. Daar komen ieder jaar een paar honderd analytisch chemici van industrie en academie. Van 19-22 april 2022 start de eerste Europese versie – EuroFAST – waar Jos Oomens ook zal spreken. ‘Ik wil daar in ieder geval over IRIS gaan vertellen en waar mogelijk ook nieuwe toepassingen laten zien’, zegt hij. ‘Het is een goed platform om contacten te leggen, en als voorzitter van de Sectie Analytische Chemie vind ik de inzichten uit het bedrijfsleven en de universiteiten een mooie combinatie.’ Scan de QR-code voor meer informatie.