Au XVIIe siècle, le marchand de Delft Antoni van Leeuwenhoek fabriquait des lentilles d’une qualité exceptionnelle, révélant pour la première fois le monde microscopique des cellules. À cette époque, la qualité de l’image dépendait essentiellement de la lentille elle-même. Aujourd’hui, cette logique a évolué. « Il s’agit désormais d’exploiter intelligemment le microscope en combinaison avec des algorithmes », explique l’ingénieur mécanicien Carlas Smith, également basé à Delft à la TU Delft. « Quelle quantité d’information est contenue dans l’image enregistrée par la caméra et comment la traiter pour obtenir la reconstruction la plus fidèle possible ? »

Avec son équipe, Smith développe différentes approches en microscopie à super-résolution. L’objectif consiste à observer des tissus vivants avec une netteté inédite. La résolution optimale d’une lentille se situe autour de 250 nanomètres, une limite imposée par la diffraction, c’est-à-dire une contrainte physique liée à la propagation des ondes lumineuses et à l’angle maximal de collecte de la lumière. Une méthode centrale de super-résolution, la Single Molecule Localization Microscopy ou SMLM, permet toutefois d’atteindre une précision largement supérieure. Cette technique repose sur l’utilisation de protéines fluorescentes et sur des algorithmes capables de reconstruire une image à partir du bruit des signaux lumineux. Elle permet d’obtenir une résolution jusqu’à vingt-cinq fois plus fine.

« Un nombre trop élevé d’itérations peut dégrader la précision »

Carlas Smith, TU Delft

En ajustant l’illumination pendant l’acquisition, selon le principe de l’Iterative Single Molecule Localization Microscopy ou ISMLM, la précision peut être encore améliorée et atteindre un facteur cent.

La technique ISMLM présente néanmoins ses propres limites. En 2022, Smith a publié avec Dylan Kalisvaart que la résolution optimale réellement atteignable avec l’ISMLM était inférieure à ce que la communauté scientifique supposait auparavant. Cela soulève une question essentielle : jusqu’où les frontières du visible peuvent-elles être repoussées ?

A priori

La SMLM repose sur des protéines fluorescentes qui, après excitation par un laser, émettent de la lumière de manière sporadique, une molécule à la fois. « Ces molécules sont enregistrées séparément et de façon répétée », explique Smith. « À chaque fois, une sous-population s’éteint pendant qu’une autre s’active. En répétant ce processus sur dix mille à trente mille images, on peut déterminer la position de toutes les molécules grâce à un algorithme de localisation. »

La localisation itérative, qui constitue la base de l’ISMLM, exploite des variations d’illumination. La distance entre le laser et la molécule influence directement l’intensité du signal fluorescent. « L’illumination fournit donc une information sur la position de la molécule fluorescente », précise Smith. « En éclairant successivement à différentes distances, on accumule progressivement davantage d’informations spatiales. »

« Lors de l’étude des cellules en 3D, la résolution temporelle reste un défi majeur »

Pablo Hernández-Varas, VIB KU Leuven

En 2020, le physicien Stefan Hell du Max Planck Institute à Göttingen et Heidelberg, lauréat du prix Nobel en 2014 pour la microscopie à super-résolution, a proposé que la résolution de l’ISMLM puisse augmenter de manière exponentielle à chaque itération. Deux ans plus tard, l’équipe de Smith a montré que cette hypothèse n’était pas applicable dans la pratique. « L’ISMLM nécessite des informations a priori, notamment une estimation de la position initiale de la molécule », explique Smith. « Ces données sont utilisées pendant l’expérience. Elles n’étaient pas prises en compte dans les calculs initiaux. En les intégrant, nous avons constaté que, dans certaines conditions, un nombre excessif d’itérations peut réduire la précision. »

Résolution temporelle

La question de l’amélioration des techniques de super-résolution dépend étroitement des objectifs de recherche. Pablo Hernández-Varas, responsable du Bioimaging Core à la VIB KU Leuven, souligne que les performances actuelles répondent déjà à de nombreux besoins. « Nos plateformes comptent environ trois cents utilisateurs actifs dans des domaines allant des neurosciences à la biologie du cancer. Une résolution spatiale d’environ vingt nanomètres est largement suffisante pour ces applications. »

« Mon travail de recherche requiert une résolution subnanométrique »

Marrit Tholen, TU Eindhoven

Pour l’étude de cellules vivantes et de molécules dynamiques, l’amélioration de la résolution temporelle apparaît comme une priorité. Marrit Tholen, ingénieure biomédicale à la TU Eindhoven, partage cette analyse. À l’aide du single molecule tracking, elle étudie le déplacement de récepteurs et de groupes glucidiques à la surface des cellules. « Nous atteignons actuellement une résolution temporelle de vingt à trente millisecondes », indique-t-elle. « Une amélioration nous permettrait de mieux comprendre la dynamique de ces récepteurs. »

Hernández-Varas précise que dans les études en trois dimensions, la résolution temporelle se situe souvent à l’échelle de la seconde. « C’est un point sensible dans nos recherches. »

Les besoins en résolution spatiale restent néanmoins présents. Tholen ajoute : « Mon domaine s’intéresse à la glycosylation des récepteurs. Il est essentiel de visualiser à la fois le récepteur et les chaînes de sucres individuelles. Cela requiert une résolution subnanométrique.

Équilibre optimal

Smith et son équipe travaillent actuellement sur des approches permettant de combiner une haute résolution spatiale et une haute résolution temporelle au sein d’un même microscope. Cette ambition implique des compromis complexes. L’acquisition d’un grand nombre d’images, nécessaire pour une résolution spatiale fine, limite la résolution temporelle. « Lorsque l’on souhaite suivre rapidement le mouvement d’une molécule, le nombre de molécules observables simultanément diminue », explique Smith. « Une augmentation de l’illumination pour couvrir un champ de vision plus large peut également induire une phototoxicité cellulaire. L’amélioration de la résolution temporelle passe donc par des acquisitions parallèles ou par de nouvelles innovations technologiques. »

À l’aide de simulations informatiques, Smith et ses collègues explorent ces équilibres. Les résultats servent à concevoir un nouveau microscope capable de combiner des données parallèles. « Nos simulations évaluent ce qui est physiquement possible avec la lumière. Elles orientent les choix de conception en fonction des objectifs scientifiques. Cela nous permet de développer des techniques de microscopie qui offrent aux chercheurs de nouvelles capacités d’observation. »