Ook tijdens deze Olympische Spelen zullen weer sporters worden betrapt op doping.Het Docolab in Gent toont de analyseroutine en het ideaal: directe urineanalyse met LC-MS. ‘Voor een analytisch chemicus kan het niet snel genoeg gaan.’

Anonieme potjes met urine van beroemde sporters. Ze arriveren per post of koerier in het kleine voorportaal van het Docolab in Gent. “Hier verifiëren we of de papieren in orde zijn. De urine krijgt vervolgens een codering van ons laboratorium”, zegt Peter Van Eenoo, onderzoeker bij het Docolab. “We kijken ook of er nergens een naam op staat. Het is verboden om op het moment van analyse te weten wiens urine het is. De analyses gebeuren in absolute anonimiteit, om de objectiviteit te waarborgen.”

Van Eenoo gaat mij voor het laboratorium in. “Hier wordt het A- van het B-staal gescheiden. Het B-staal gaat in de vriezer voor een eventuele contra-expertise. Op het A-staal voeren we de analyse uit. Dat doen we in batches met meerdere urinestalen tegelijk, waarbij we een aantal kwaliteitscontroles meenemen, zoals een blanco waterstaal en een blanco urinestaal. Zo kunnen we achteraf aantonen dat geen van onze reagentia gecontamineerd is geweest. We nemen ook een positieve controle mee in de vorm van urine waaraan de dopingstoffen die we voorhanden hebben zijn toegevoegd. Aan de urinestalen voegen we nog een interne standaard toe.”

Ether

Een ijle geur van ether verraadt dat in dit deel van het lab de voorbewerking van de urinestalen plaatsvindt. Tientallen reageerbuizen met allerlei tinten urine tuimelen op een rollenbank. “We beginnen met een aantal milliliters urine, die we na vloeistof/vloeistofextractie en verdampen oplossen in enkele microliters. Het is enerzijds een concentratiestap, anderzijds een opschoningsstap om oninteressante stoffen kwijt te raken. Voor anabolica, corticosteroïden en stimulantia doen we bijvoorbeeld een extractie bij alkalische pH met ether.” Na het verdampen van de organische fase en oplossen van het residu vindt voorafgaand aan GC-MS een derivatiestap plaats om de te analyseren componenten volledig apolair te maken.

De extractie- en analysemethodes worden niet voorgeschreven door het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA). De validatiecriteria staan wel vast, plus de detectiegrens voor een bepaalde stof. “Maar WADA dicteert niet het extractiemiddel of hoe we de analyse moeten uitvoeren. Vier maal per jaar krijgen we van WADA vijf stalen waarin we verboden middelen moeten aantonen. Doe je dat niet goed, dan raak je je accreditatie kwijt.”

We gaan de tweede labruimte binnen, waar een dozijn GC- en LC-apparaten op een rij staan. “Bij de analyse kijken we naar bepaalde iontraces. Twee personen doen onafhankelijk van elkaar een visuele controle. Nadien gaan ze de resultaten vergelijken.” Als dat tot een verdachte uitslag leidt, vindt een herhaling van de analyse plaats, uitgaande van hetzelfde A-staal. Pas als die test ook positief uitvalt, rapporteren we naar de sportorganisatie die de urinestaal heeft opgestuurd.

Urine-injectie

De analysemethode is geleidelijk aan het veranderen, zegt Van Eenoo. “Op dit moment is de verhouding tussen bepaling op GC-MS of LC-MS ongeveer 50-50. Vier jaar geleden was dat nog 90-10. Zelfs van substanties zoals vluchtige stimulantia, waarvan je denkt dat ze bij uitstek geschikt zijn voor GC, blijkt dat LC minstens even krachtig is. LC-MS is ook gevoeliger en het biedt een aantal bijkomende mogelijkheden, zoals directe urineanalyse, waarbij je zonder enige staalvoorbereiding – hooguit een filtratiestap – urine in je analysetoestel injecteert. Dat zal een hoop tijd besparen en het scheelt in je meetonzekerheid. Iedere bewerkingsstap – extractie, concentratie – introduceert onzekerheid. Bij directe bepaling hoef je hooguit een interne standaard toe te voegen.”

We verwachten dat LC-MS in de toekomst geleidelijk de plaats van GC-MS zal innemen, zegt de directeur van het Docolab, Frans Delbeke. “We hebben al een aantal directe urineanalysemethodes die werken, bijvoorbeeld de kwantitatieve bepaling van efedrines.”

Daarnaast streeft Delbeke ernaar LCMS-methodes te ontwikkelen voor de analyse van peptidehormonen, zoals epo en groeihormoon. Epo wordt nu bepaald met een arbeidsintensieve immunologische methode: gelectroforese gevolgd door dubbele immunoblotting en chemoluminiscentie.

Delbeke: “Uiteindelijk heb je toch het liefst een massaspectrum. Bij immunologische bepalingen krijg je kruisreacties, je hebt veel onzekerheden. En als je geen meetresultaat krijgt, dan weet je niet welke van die honderd handelingen die je hebt verricht is misgegaan. Daar komt bij dat een analyse twee dagen duurt. Voor een analytisch chemicus kan het niet snel genoeg gaan.”

Designerdoping

Het Docolab in Gent analyseert jaarlijks zo’n 6.800 urinestalen. Dit jaar is daar een grote stroom bloedstalen bij gekomen. Dagelijks komen vier tot vijf pakketten met buisjes bloed binnen als gevolg van de invoering van het hematologisch paspoort in de internationale wielersport. Daarbij wordt bij een sporter meerderde malen bloed afgenomen om een individueel bloedwaardenprofiel op te stellen.

Voor het hematologisch paspoort wordt gekeken naar het hemoglobinegehalte, de verhouding tussen rode bloedcellen en bloedplasma (hematocriet) en het percentage jonge, rode bloedcellen (reticulocyten). Delbeke: “Aan de hand van die drie parameters en een formule is het mogelijk om bij een afwijkende meetwaarde te bepalen of die man of vrouw aan de epo heeft gezeten. Wellicht dat in de toekomst ook een individueel steroïdenpaspoort wordt ingevoerd.”

Het Docolab maakt onderdeel uit van de universiteit en dat is bepalend voor de gedrevenheid waarmee naast routinebepalingen nieuwe methodes worden ontwikkeld. “We zijn er fier op dat we op het gebied van research naar dopinganalyse nummer twee zijn in de wereld, na het lab in Keulen. Met het onderzoek streven we er bijvoorbeeld naar om methodes te ontwikkelen waarbij we de analyseroutine vereenvoudigen tot één analysemethode voor GC-MS en één voor LC-MS.”

Hoewel de lijst van verboden stoffen niet heel snel groeit, kunnen nieuwe dopingmiddelen in zwang raken. Een bekend voorbeeld is het anabole steroïde tetrahydrogestrinon (THG), waarop onder meer meervoudig Olympisch sprintkampioene Marion Jones is betrapt. Delbeke: “Het probleem is dat wij moeten weten waarop we moeten monitoren. Maar om te weten welke ionen je moet volgen, moet je weten hoe de moleculen in elkaar zitten. Door te spelen met de structuur van anabole steroïden – een dubbele binding weg te laten bijvoorbeeld – krijg je een designersteroïde dat dopinglabs niet kunnen detecteren. Je kunt je voorstellen dat op een blauwe maandag een scheikundige en een farmacoloog een nieuw designersteroïde ontwikkelen. We proberen met LC-MS een methode te ontwikkelen waarbij we een signaal krijgen dat er steroïden zijn gebruikt, zonder precies te weten welke. Met de methode van precursor ion scanning kunnen we ook de detectietijd verlengen van bepaalde steroïden, lang nadat de inname is gestopt.”

Delbeke gaat over twee jaar met pensioen. Sinds zijn aantreden begin jaren zeventig heeft hij de dopinganalyse en de laboratoriumapparatuur een doorlopende evolutie zien doormaken. Delbeke: “We blijven het misbruik achterna hinken. Maar de periode tussen het ontwikkelen van een nieuw dopingproduct en het detecteren in het lab is wel korter geworden.”

www.wada-ama.org

www.docolab.ugent.be

Bron: C2W15, 16 augustus 2008