De massaspectrometrie stond de laatste jaren niet stil. Zowel de gevoeligheid als de snelheid namen flink toe. En daar plukt de fosfoproteomics de vruchten van.
‘De massaspectrometer kun je niet meer wegdenken uit het hedendaagse fosforyleringsonderzoek. Je brengt er nieuwe of onbekende gefosforyleerde eiwitten mee in kaart. En je kunt er perfect mee inzoomen op specifieke fosfosites’, zegt Kris Gevaert. Hij is vice-afdelingsdirecteur van het medical biotechnology center van het Vlaams Instituut voor Biotechnologie en hoogleraar biochemie aan de Universiteit van Gent.
‘Je kunt perfect inzoomen op specifieke fosfosites’
Fosforylering, een fosfaatgroep koppelen aan een eiwit, is een essentieel onderdeel van een cel. Het is de aan- en uitschakelaar van veel signaaltransductiewegen. Tot enkele jaren terug was de MS-analyse van gefosforyleerde eiwitten behoorlijk lastig. Het probleem vormde de instabiele fosfaatgroep zelf. Inmiddels is de techniek zover verbeterd dat onderzoekers binnen het vakgebied fosfoproteomics zich flink kunnen verheugen.
Verbeterde stappen
Dat verheugen begint al bij de voorbereiding van je monster. Omdat er veel meer niet-gefosforyleerde eiwitten in een monster zitten dan gefosforyleerde, kun je te maken krijgen met een te lage concentratie aan die laatste groep eiwitten. Daardoor zijn fosfopeptides niet zichtbaar in je spectrum. Je moet je monster dus verrijken. De populairste methodes voor fosfopeptiden zijn metal oxide affinity chromatography (oftewel MOAC, met bijvoorbeeld titaniumdioxide) en immobilized metal affinity chromatography (IMAC).
‘Beide methodes zijn de laatste jaren veel gevoeliger, efficiënter en robuuster geworden en nu ook geïntegreerd in automatische systemen. De lastigheid van gefosforyleerde eiwitten verrijken is hiermee voor een deel opgelost’, stelt Maarten Altelaar, universitair hoofddocent bij de vakgroep biomoleculair mass spectrometry and proteomics van de Universiteit Utrecht.
Een voldoende verrijkt monster spuit je in je LC-MS-opstelling. Eenmaal aangekomen in de MS ioniseren de peptides meestal via een elektrospray. Hoe positiever een peptide is geladen, hoe beter het ‘vliegt’ met een intensere piek als gevolg. Maar gefosforyleerde eiwitten bevatten door hun fosfaatgroep een extra negatieve lading. Toch is dat al lang niet meer zo’n probleem als vroeger, weet Altelaar. ‘Nieuwe ontwikkelde sources, de plek waar de elektrosprayionisatie plaatsvindt, laten meer ionen binnen en kunnen ze ook beter verwerken. De ion load, zoals dat heet, is omhooggegaan. Dat scheelt aan gevoeligheid ten opzichte van een paar jaar terug zeker een factor 10.’
Aan de hybride-variant hangt wel een flink prijskaartje
En dat is niet de enige verbetering die de MS de laatste jaren onderging. Ook de manier van fragmenteren, stap twee in de MS-analyse, is aanzienlijk onder handen genomen. Lange tijd gebruikte je voornamelijk collision-induced dissociation (CID) in een ion-trap. Daarbij botst je peptide met gasmoleculen, waarna de interne energie stijgt en het peptide in stukken uiteenvalt. Botsingen die plaatsvinden in een collision-cel kun je met meer energie uitvoeren door de peptides harder – met zo’n twintig à dertig keer zoveel energie als bij CID – op gasmoleculen te laten knallen. Dit heet hogere energie-CID, of HCD. Daarnaast bestaan er ook elektronen-gebaseerde fragmentatietechnieken, zoals electron transfer dissociation (ETD).
Hybridespectrum
De nieuwste massaspectrometers combineren HCD met ETD: EThcD. Er bestaan nog maar een paar massaspectrometers – met een prijskaartje van ruim € 1 miljoen per stuk – die deze hybride-fragmentatietechniek toepassen. Een daarvan staat in het lab van Altelaar. Hij legt uit hoe de techniek werkt: ‘Je doet eerst een ETD-stap. Daarbij breng je een elektron over op het te analyseren peptide. Je krijgt een radicaal en een heel klein beetje fragmentatie. Bij alleen ETD moet je het vervolgens activeren om het proces af te maken. In plaats daarvan neem je het radicaal en breng je dat naar een HCD-cel. Daar gebeuren twee dingen tegelijkertijd: het radicaal wordt geactiveerd (ETD) en tegelijkertijd botsen de gasmoleculen met hoge snelheid (HCD).’
EThcD heeft één nadeel: tijd
‘EThcD levert je veel extra informatie op’, vertelt Gevaert, die zegt helaas niet in het bezit te zijn van zo’n massaspectrometer. ‘Je krijgt een hybridespectrum, waardoor je makkelijk zowel de peptidesequentie bepaalt als de correcte plaats van fosforylering achterhaalt. Dat laatste is vooral handig als twee fosforyleerbare aminozuren dicht bij elkaar zitten en je wilt weten welke van de twee een fosfaatgroep gebonden heeft.’ Toch kent EThcD ook een nadeel, en dat is tijd. Altelaar: ‘We gebruiken het nu vooral voor heel moeilijke peptidesequenties, bijvoorbeeld grote eiwitten of eiwitten met meerdere fosfaatgroepen.’
Specifiekere algoritmes
Een heel andere fragmentatietechniek, die in opkomst is, is ultraviolet-photodissociation (UVPD). Onlangs publiceerden collega’s van Altelaar over het gebruik van die techniek binnen de fosfoproteomics. ‘In plaats van dat je je peptides laat botsen met gasmoleculen, schijn je er een uv-laser op. De fotonen geven de peptides de energie om te fragmenteren. Je krijgt veel fragmentatie-ionen en daardoor veel sequentie-informatie.’
De MS-apparatuur zelf is niet het enige waarop de laatste paar jaar flink vooruitgang is geboekt. Ook algoritmen verbeteren steeds meer, doordat de datasets waarop ze worden getraind steeds groter worden. ‘Ook krijg je gaandeweg steeds specifiekere, meer op fosfopeptides afgestemde algoritmes, zoals MaxQuant’, voegt Altelaar toe. ‘Die software genereert informatie over specifieke fosfosites.’
De manier van analyseren verschuift eveneens. Gevaert: ‘De meeste onderzoekers doen aan data-afhankelijke MS-analyse. Dat gaat als volgt: peptides die voldoen aan bepaalde ingestelde criteria, zoals intensiteit en lading, selecteer je voor fragmentatie. Daarna gebruik je de fragmentatiespectra om de peptides te identificeren. Dat betekent dat je een aantal peptides nooit identificeert, omdat ze bijvoorbeeld te weinig voorkomen. Dat is het geval bij fosfopeptides.’
Target proteomics is vol in opkomst
‘Bij data-onafhankelijke analyse’, vervolgt de Gentse hoogleraar, ‘selecteer je niet vooraf en neem je álle peptides binnen een zo groot mogelijk massa-ladingbereik mee. De uitdaging is nu om het verkregen fragmentatiespectrum uiteen te rafelen en aparte spectra aan peptides te koppelen. Hiervoor gebruik je specifieke fragmentenbibliotheken. Dat klinkt allemaal lastig, maar die methode is heel handig wanneer je specifiek kijkt naar gemodificeerde eiwitten, waaronder gefosforyleerde.’
Een andere ontwikkeling is de opkomst van target proteomics. ‘Je stelt daarbij de massaspectrometer zo in dat die alleen kijkt naar de eiwitten waarin jij geïnteresseerd bent’, zegt Altelaar. ‘Je geeft daarbij de precursormassa van de peptide op, de te verwachten elutietijd en in welke fragmenten het waarschijnlijk uiteenvalt. Het voordeel hiervan is dat je zo heel veel korte runs van veel monsters kun doen. Die techniek wordt steeds meer ingezet voor gefosforyleerde eiwitten.’
Ontzettend veel data
De gevoeligheid en de snelheid van MS-analyse zijn dankzij alle genoemde verbeteringen op apparaat- en softwareniveau flink gestegen. Gefosforyleerde eiwitten kun je nu beter dan ooit identificeren en bestuderen. Zijn er nog wel obstakels om te overwinnen in dit vakgebied? ‘Het nieuwe probleem,’ lacht Altelaar, ‘is dat we ontzettend veel data genereren. Voor de toekomst is er dus nóg betere software nodig om dat allemaal te analyseren en interpreteren.’
Nog geen opmerkingen