Lang was röntgendiffractie dé methode om de kristal­structuur van een stof te bepalen. Tegenwoordig is er ook hernieuwde belangstelling voor neutronen- en elektronen­diffractie. Wanneer is welke techniek het best? En is kristalliseren vooraf echt altijd nodig?

Röntgendiffractie is niet meer weg te denken uit de structuuranalyse. Er zijn al honderdduizenden kristalstructuren mee opgehelderd en jaarlijks komen daar nog eens tienduizenden bij. Aan de basis van die techniek staat de ontdekking van natuurkundige Max von Laue uit 1912 dat een kristal met zijn driedimensionale symmetrie kan dienen als een soort rooster voor röntgenstraling, precies zoals zichtbaar licht op tralies. Hiermee bevestigde Von Laue de roosterstructuur van kopersulfaatkristallen. Twee jaar later ontving hij de Nobelprijs voor de Natuurkunde voor zijn ontdekking van die verstrooiing van röntgenstraling door kristallen.

Bij röntgendiffractie stuur je röntgenstraling met een specifieke golflengte af op het te analyseren kristal. De elektronenwolk rondom de atomen verstrooit die stralen en de periodiciteit en de symmetrie van het kristal leveren op een unieke manier een zogenoemd diffractiepatroon op. Een detector vangt dit verstrooiingspatroon op, de computer maakt er een reflectielijst van en speciale algoritmes berekenen hieruit de rangschikking van atomen en daarmee de kristalstructuur van de te analyseren stof.

Toch is röntgendiffractie niet de enige vorm van diffractie waarmee je structuren kunt ophelderen. De laatste jaren timmeren ook neutronendiffractie en elektronendiffractie stevig aan de weg, waarop je respectievelijk neutronen en elektronen op je kristal afvuurt. Maar wanneer zet je welke methode in?

Sponsmethode

Voor je kunt analyseren, moet je van de te analyseren stof eerst een kristal maken. ‘Dat is nodig, want verstrooiing door één molecuul is te zwak om te kunnen meten’, legt Remy Loris uit. Hij is onderzoekprofessor röntgenkristallografie aan de Vrije Universiteit Brussel en het Vlaams Instituut voor Biotechnologie. ‘Een kristal is eigenlijk een verzameling van identieke moleculen met allemaal dezelfde oriëntatie, zoals een motief van behangpapier, maar dan driedimensionaal. Dat versterkt het verstrooiingssignaal enorm.’

Kristalliseren is een stof tot supersaturatie brengen: het naar een concentratie brengen boven de grens van oplosbaarheid.
‘Op dat ogenblik kunnen er twee dingen gebeuren: de stof vormt kristallen of er ontstaat een amorf precipitaat. Dit kun je eigenlijk niet voorspellen, er komt een hoop trial and error bij kijken’, zegt Loris.

Gelukkig kun je sinds kort die lastige kristallisatie in sommige gevallen omzeilen. Drie jaar geleden kwam de Japanse onderzoeker Makoto Fujita met een geheel nieuwe manier om monsters te preparen voor röntgendiffractie: de kristallijne sponsmethode (zie het interview met Fujita in deze editie). Vorig jaar berichtte het Japanse team zelfs dat ze met die techniek in combinatie met röntgen­diffractie de stereochemie hadden bepaald van axiale en planair chirale moleculen, iets dat voorheen bijzonder uitdagend werk was.

Het is geen wonder dat deze techniek de aandacht trok van zowel de academische als de bedrijfswereld. Dat merkte ook Réne de Gelder, universitair docent chemische kristallografie aan de Radboud Universiteit Nijmegen. ‘DSM benaderde ons om eens te kijken of we die kristallijne sponsmethode zouden kunnen inzetten bij een probleem dat daar, maar ook bij andere chemiefabrikanten, al jaren speelt. Namelijk: de structuren ophelderen van onzuiverheden in het productieproces. Die ongewenste bijproducten kun je moeilijk verleiden om tot een kristal te komen. Bovendien werk je met heel kleine hoeveelheden. De kristallijne sponsmethode zou daarbij een enorme uitkomst kunnen zijn.’

Verstrooiing door één molecuul is te zwak

Gastheerkristal

Het geheim van de kristallijne sponsmethode is dat je niet de te analyseren stof laat kristalliseren, maar een stof waarvan de kristalstructuur bekend is. Dit gastheerkristal, of kristallijne spons, bevat holtes die toegankelijk zijn voor andere moleculen. Zo komen die moleculen alsnog in
een kristallijne matrix terecht en kun je er röntgendiffractie op loslaten. ‘Je krijgt dan een diffractiepatroon met zowel bijdragen van de gastheer als de onbekende stof. Het is dan vrij simpel om de onbekende driedimensionale structuur van het gastmolecuul eruit te filteren’, weet De Gelder.

Het grote voordeel van de kristallijne sponsmethode is dat je in theorie van bijna elk soort molecuul de structuur kunt bepalen. ‘Zolang je molecuul past in de holtes van het gastheerkristal, kun je het analyseren. In de toekomst zou je dan bij wijze van spreken potjes op het lab kunnen hebben staan met gastheerkristallen in alle vormen en maten en dan kies je per te analyseren monster precies het juiste kristal. Dat is althans de hoop van velen.’

Vooralsnog is het project van De Gelder en zijn collega’s pas net begonnen (sinds half juli dit jaar). De Gelder: ‘Het is nu eerst zaak de kristallijne sponsmethode stap voor stap goed in de vingers te krijgen. Daarna willen we uitvogelen hoe breed toepasbaar de techniek is. Zijn er moleculen die je absoluut niet in een gastheerkristal krijgt, omdat het bepaalde eigenschappen bezit? Kun je voor elk soort molecuul een geschikt gastheerkristal vinden? En uiteindelijk ook: is de techniek bruikbaar in combinatie met neutronen- en elektronendiffractie? We zijn erg nieuwsgierig naar de antwoorden op al die vragen.’

Neutronen

Wanneer je het monster hebt geprepareerd, is het tijd voor de diffractie zelf. Voor neutronendiffractie in Nederland moet je zijn bij het Reactor Instituut van de TU Delft. Daar staat de neutronenpoederdiffractometer PEARL. PEARL staat in dezelfde ruimte als de neutronenbron die hij gebruikt. ‘De reactorkern geeft neutronen van heel veel verschillende energieën af’, legt universitair docent Lambert van Eijck uit, die PEARL bouwde. ‘Voor diffractie heb je er maar een nodig. Een monochromator selecteert die. De neutronenbundel schijnt op je monster, dat in poe­der­vorm in het midden van het experiment staat. Door botsing van de neutronen met de atoomkernen van je moleculen, vindt er verstrooiing van de neutronen plaats. De hoek waaronder dit plaatsvindt, meet je, en zie je terug in een diffractogram. Daaruit kun je vervolgens de kristalstructuur bepalen.’

Er zijn enkele tientallen neutronenbronnen in de wereld, en de reactor van Delft is bepaald niet sterkste: hij levert 2 MW (ter vergelijking: de meeste neutronenbronnen voor onderzoek hebben een vermogen tussen de 10 en de 60 MW). Daardoor zouden de pieken in theorie niet zo scherp zijn, maar door een slim ontwerp doet PEARL nauwelijks onder voor andere neutronenpoederdiffractometers. In sommige gevallen is hij zelfs beter. ‘Door het slimme ontwerp levert PEARL superscherpe diffractiepatronen op. PEARL blijkt zelfs zo goed te werken dat we onlangs hebben besloten om ook onderzoekers buiten de TU Delft toe te laten tot het instrument.’

Een monochromator selecteert de energie

Lichtere elementen

Wat maakt een tripje Delft nu écht de moeite waard? Neutronendiffractie heeft een groot voordeel boven de klassieke röntgendiffractie en dat is dat je er veel beter de lichtere elementen mee kunt zien. Dat werkt als volgt. Zoals eerder genoemd interacteren röntgenstralen met elektronen. Een neutronenbundel doet dat juist met atoomkernen. De kans op interactie, en daarmee verstrooiing, neemt bij röntgendiffractie kwadratisch toe met het aantal elektronen van een atoom. Dat betekent: hoe hoger het atoomnummer (en daarmee het aantal elektronen), hoe groter de kans op interactie. Waterstof (atoomnummer 1) is voor röntgenstraling dus een stuk lastiger te zien dan ijzer (atoomnummer 28). ‘Neutronen daarentegen interacteren voornamelijk met de atoomkern. De zware elementen hebben dan ongeveer evenveel interactiekans als de lichtere elementen. Het pluspunt van neutronendiffractie is dan ook dat je lichtere elementen (waterstof, koolstof, stikstof, zuurstof, lithium) goed kunt zien in een omgeving van zware elementen. Oftewel: een combinatie van organisch en anorganisch’, legt Van Eijck uit.

Maar neutronendiffractie kan nog meer. Van Eijck: ‘Je kunt waterstofatomen vervangen door deuterium en daarmee zie je een duidelijke verandering in je diffractie, terwijl de chemische eigenschappen van het monster gelijk blijven. Dat komt doordat de atoomkern van die twee isotopen verschilt, en daarmee de interactie met de neutronenbundel. Zoiets is niet te zien met röntgendiffractie.’ Ook zijn atomen als bijvoorbeeld mangaan en ijzer, die voor röntgenstraling vrijwel identiek zijn omdat ze naast elkaar staan in het periodiek systeem, met neutronen juist heel goed te onder­scheiden.

Daarnaast kun je met neutronendiffractie perfect magnetische atomen opsporen. En als laatste pluspunt kun je er veel dieper mee in je materiaal kijken. Samengevat is neutronenpoederdiffractie het meest geschikt om in te zoomen op substanties in de brandstofstaven van reactoren, batterijen, waterstofbrandstofcellen, magnetische koelingen en bepaalde katalysatoren.

Elektronen

Heb je een eiwit en wil je daarvan de kristalstructuur bepalen? Dan is neutronenpoederdiffractie ongeschikt. ‘Eiwitten vormen vaak heel kleine kristallen die ook nog eens zacht en kwetsbaar zijn, omdat ze samen worden gehouden door slechts beperkte intermoleculaire krachten’, vertelt Loris, die zich bezighoudt met onderzoek naar de eiwitten betrokken bij de persistentie van bacteriën.

En dus zijn er voor eiwitten, en andere complexe biologische moleculen, maar twee opties over: röntgendiffractie of elektronendiffractie. ‘Die laatste methode geniet de voorkeur wanneer je echt heel kleine kristallen hebt én maar een kleine hoeveelheid stof tot je beschikking’, zegt Igor Nederlof. Hij promoveerde in 2012 op het onderwerp 3D-elektronen­krist­al­lografie in structuurbiologie en werkt nu bij Amsterdam Scientific Instruments. Daar probeert hij momenteel een nieuwe elektronendiffractiedetector naar de markt te brengen.

Toch kent ook elektronendiffractie nadelen. ‘Elektronen hebben zo’n sterke interactie met kristallen dat er altijd veelvuldige verstrooiing optreedt’, vertelt Jouk Jansen, onderzoeker aan de TU Delft. ‘Dat wil zeggen: hetzelfde elektron wordt meer dan eens afgebogen in het kristal, zelfs als het kristal slechts 10 nm dik is. Dat maakt structuuranalyse een stuk ingewikkelder, aangezien het diffractiepatroon dan niet meer simpelweg de zogenoemde Fourier-getransformeerde is van de kristalstructuur.’

Nederlof herkent dit probleem. ‘Bij röntgendiffractie heb je eveneens te maken met dynamische verstrooiing, maar bij elektronen zijn die events veel talrijker. Wat je ertegen kunt doen? Hoe kleiner en dunner je monster, hoe beter. Er zijn tevens algoritmes beschikbaar die ervoor kunnen corrigeren tijdens de analyse.’ Jansen heeft een dergelijke verfijnings­methode ontwikkeld. ‘Door de kleinste kwadraten-methode te combineren met de multi-slice-methode, wordt je kristalstructuur veel nauw­keuriger.’

Hoe kleiner en dunner je monster, hoe beter

Unieke eigenschappen

Samengevat kent elke vorm van diffractie zijn eigen sterktes en zwaktes, die te maken hebben met wat ze precies ‘zien’. Met röntgendiffractie ‘kijk’ je naar de elektronenschil rond atomen, met neutronendiffractie maak je atoomkernen zichtbaar en met elektronendiffractie analyseer je zowel atoomkernen als elektronenschillen. Röntgendiffractie doet het goed met kristallen van ongeveer 0,1 mm groot, wanneer je een in-house röntgendiffractometer gebruikt. Als je toegang hebt tot een synchrotonfaciliteit kun je kristallen van slechts enkele micrometers groot ‘zien’. Dit terwijl neutronendiffractie kristallen groter dan een millimeter nodig heeft. Elektrondiffractie neemt alleen genoegen met de kleinste kristallen: 10 tot 100 nm. Kortom, zoals Jansen het samenvat: ‘Röntgen-, neutronen-, en elektronendiffractie zijn technieken die elk hun unieke eigenschappen hebben en elkaar daarom perfect aanvullen.’